Portail IP   bandeau_genéral
imprimer
Imprimer
     Repliement et Modélisation des Protéines


  Responsable : GOLDBERG Michel (goldberg@pasteur.fr)


  resume

 

L'Unité combine la génétique, la biochimie et la physico-chimie des protéines pour étudier divers problèmes liés à leur structure, leur fonction et leur intégration dans divers processus cellulaires tels que l'acquisition de leur conformation fonctionnelle ou les mécanismes de transmission moléculaire de la conformation anormale d'agents pathogènes non conventionnels (protéines "prion").



  rapport

cale

Une équipe de l'unité s'intéresse à la conformation de la protéine PrP dans le prion. Une seconde s'intéresse aux mécanismes moléculaires de reconnaissance et de régulation cellulaires liés à la présence de protéines bactériennes incorrectement repliées et, parallèlement à ces études fondamentales, développe des stratégies de clonage pour la production de protéines recombinantes.

1- Approche immunochimique de la conformation de la protéine PrP dans le "Prion" (M.-C. Blom-Potar, P. Bittoun, M. Cardona, P. Falanga, M. Goldber et M. Hontebeyrie)

Le prion est l'agent infectieux responsable d'encéphalites spongiformes comme la tremblante du mouton, la Maladie de la Vache Folle, ou la maladie humaine de Creutzfeldt-Jakob. Le prion est constituté d'une protéine, la PrP, présente chez l'individu sain comme chez le malade. Cependant, la conformation (forme dans l'espace) de la PrP chez l'individu sain est différente de celle de la PrP dans le Prion. C'est cette différence que le groupe "Prion" cherche à catactériser à l'aide d'anticorps spécifiques. Outre leur intérêt purement scientifique, ces recherches visent à l'amélioration de la sensibilité des tests de détection du prion chez les individus ou les animaux potentiellement infectés.

Le groupe a pu cette année mettre en place tous les outils techniques et biologiques nécessaires à ses travaux: élevage de souris transgéniques exprimant la PrP du mouton (fournies par H. Laude - INRA), anticorps spécifiques de la PrP (fournis par J. Grassi - CEA), tests d'infectiosité du prion, cultures de lignées cellulaires produisant le prion, ...

Après avoir l'an dernier isolé un clone cellulaire produisant des quantités importantes de la PrP, nous avons réussi cette année à infecter des cultures de cette lignée et à montrer qu'elle produit alors des quantités importantes de prion. La détermination de la quantité de prion produite par ces cellules est en cours.

L'étude, que nous envisageons de faire, de la réactivité du prion vis-à-vis d'anticorps capables de se fixer à la partie structurée de la PrP pathogène, ne peut se faire sur le prion "naturel". En effet, à la partie purement protéique de la PrP naturelle sont attachées deux importantes structures moléculaires formées de sucres complexes qui, dans le prion, forment une "carapace" qui recouvre la protéine et le rend inaccessible aux anticorps. Nous avons donc cherché à éliminer ces sucres pour permettre l'étude conformationnelle de la protéine prion. Pour cela nous avons cultivé des cellules productrices de prions en présence d'un inhibiteur de glycosylation (molécule empêchant l'attachement des sucres aux protéines). Les conditions optimales d'utilisation d'un tel inhibiteur ont été déterminées. Elles nous ont permis d'obtenir une préparation de prions "non-glycosylés" dont nous avons entrepris la caractérisation antigénique. Dans ce but, nous avons d'abord mis au point un test immunologique miniaturisé de forte sensibilité (spot test - cf figure 1) qui permet de tester la réactivité d'un anticorps vis-à-vis de la PrP normale structurée ou déstructurée, de la PrP structurée non-glycosylée, du prion glycosylé structuré ou non structuré, et du prion non-glycosylé structuré.

Nous avons ainsi pu vérifier que, parmi les nombreux anticorps analysés et qui reconnaissent la partie centrale de la PrP normale, aucun ne se lie au prion glycosylé naturel structuré. Parmi eux, nous en avons cependant identifié deux qui se lient au prion non-glycosylé structuré. Cette observation confirme que les sucres empêchent effectivement certains anticorps de réagir avec le prion. De plus, la réactivité de ces deux anticorps vis-à-vis du prion non-glycosylé nous a permis d'identifier deux regions de la PrP qui, dans sa conformation pathogène (le prion) sont disposées à la surface de la protéine. L'un de ces deux anticorps nous a été fourni par le CEA. Le second provient d'un hybridome nouveau préparé, dans le cadre de notre projet, en collaboration avec F. Nato et J. Grégoire (Plateau Technique d'Expression et Purification des Protéines de l'Institut Pasteur dirigé par P. Béguin). Cet hybridome "anti-PrP" est l'un des 33 obtenus jusqu'ici après immunisation de souris à l'aide de peptides synthétiques correspondant à des régions distinctes de la PrP et qui devraient permettre une cartographie de la surface de la PrP au sein du prion. Nous espérons également obtenir des anticorps "conformationnels" capables de se lier au prion mais pas à la PrP normale; si tel était le cas, nous disposerions d'un réactif susceptible d'augmenter la sensibilité des tests de détection du prion chez les animaux non symptomatiques suspects de contamination.

2- Repliement dans le périplasme bactérien (N. Sassoon-Clavier, M. Miot et J.-M. Betton)

Chez les bactéries à Gram négatif, la compartimentation cellulaire impose un contrôle précis du repliement des protéines qui exercent leur fonction biologique dans l'enveloppe bactérienne. Afin d'étudier les différents aspects du repliement des protéines de l'enveloppe, nous utilisons l'expression d'un mutant d'une protéine périplasmique modèle, la protéine affine du maltose ou MalE31, dont le repliement défectueux conduit à l'accumulation d'espèces protéiques incorrectement repliées qui s'agrègent et forment des corps d'inclusion dans le périplasme bactérien. Au niveau cellulaire, nous venons de montrer que l'expression de précurseurs possédant des mutations de séquence signal défectueuses permettait une élimination plus efficace des conformations protéiques incorrectes. Ces résultats montrent que les facteurs cellulaires, chaperons et protéases, qui interviennent au cours du repliement pour réparer ou éliminer les protéines mal repliées, sont plus actifs sur MalE31 ou plus nombreux dans le cytoplasme que dans le périplasme. Au niveau moléculaire, nous avons résolu, en collaboration avec l'Unité d'Immunologie Structurale, la structure cristalline de MalE31. Les résultats obtenus démontrent clairement que le défaut de repliement de ce mutant s'exerce au niveau d'intermédiaires du repliement cellulaire. Cependant, grâce à l'activité chaperon de la peptidyl-prolyl isomérase périplasmique FkpA que nous avions démontrée, l'obtention d'une forme soluble de MalE31, possédant une affinité pour le maltose comparable à celle de la protéine sauvage, a été réalisée, et nous avons ainsi caractérisé les propriétés de transport du maltose de ce variant dont le repliement cellulaire est défectueux. Dans ces conditions expérimentales, MalE31 est incapable de former un complexe productif avec le transporteur membranaire du maltose. L'examen de sa structure, qui ne renseigne pas sur le mécanisme de repliement défectueux de MalE31 a néanmoins permis d'identifier un nouveau site d'interaction avec les protéines MalF et MalG.

Par ailleurs, nous avons étudié l'effet de la température sur la croissance des bactéries surexprimant malE31, et avons observé que si aucun phénomène d'interférence ou d'inhibition de l'exportation, lié à la surproduction de ce variant, n'était détecté à 30°C, un phénotype thermo-sensible (et létal) pouvait s'observer à 37°C, mais pas à 42°C. En effet, dans ces conditions de stress thermique, la protéine est rapidement dégradée et les corps d'inclusion ne se forment pas. À partir de ces observations, nous avons montré que l'expression de malE31 à 37°C induisait une réponse au stress extracytoplasmique médié par le système à deux composants CpxA/CpxR. De plus, l'expression périplasmique de variants de MalE, déstabilisés mais qui contrairement à MalE31 ne s'agrègent pas, induisent également cette voie de signalisation. Sur la base de la toxicité liée à l'expression d'une fusion MalE31-PhoA, nous avons initié la recherche de suppresseurs du phénotype toxique lié à l'agrégation massive de MalE31 dans le périplasme à 37°C. Une banque de gènes d'E. coli a été construite en clonant des fragments d'ADN dans un vecteur d'expression multicopie. A partir de cette banque, nous sélectionnerons ou criblerons les clones capables de restaurer la croissance de la souche surproduisant la fusion MalE31-PhoA.

3- Protéases ClpP de Mycobacterium tuberculosis (N. Benaroudj et M. Miot)

Les protéines Clp sont des protéases autocompartimentées et dépendantes de l'ATP, qui sont impliquées dans la survie et la virulence de nombreuses bactéries. Chez E. coli, les protéases Clp sont formées d'une sous-unité protéolytique, ClpP, et d'une sous-unité ATPasique, ClpA ou ClpX. Les sous-unités ClpP s'assemblent en tétradécamère, composé de deux anneaux héptamériques qui se superposent. Chez M. tuberculosis, ces protéases n'ont jamais été étudiées, mais le séquençage du génome a mis en évidence la présence de deux gènes codant pour les protéines ClpP (ClpP1 et ClpP2). Nous avons produit chez E. coli, purifié et initié la caractérisation des protéines ClpP1 et ClpP2 de M. tuberculosis. Les résultats préliminaires indiquent que ces deux protéines, produites individuellement, ne sont pas capables d'hydrolyser des peptides et forment uniquement des complexes heptamériques dans les conditions expérimentales testées. Nous espérons mettre en évidence des spécificités dans les mécanismes d'action de ces protéases qui pourraient être reliées à une fonction dans la survie et virulence de M. tuberculosis. À plus long terme, nous étudierons aussi les protéines de stress, dont les chaperons moléculaires. En effet, M. tuberculosis possède des chaperons de la famille de DnaK et GroEL (déjà bien caractérisées chez E. coli), mais aussi de nouvelles protéines de stress dont la fonction est totalement inconnue.

4- Production de protéines recombinantes du virus du SRAS (J.-M. Betton et J. Rogé)

Grâce aux développements récents des systèmes de transcription-traduction acellulaire, nous avons développé une nouvelle stratégie de clonage-expression qui est basée sur la possibilité d'exprimer un gène in vitro à partir d'un produit PCR. Cette stratégie qui permet une optimisation rapide des paramètres d'expression du gène recombinant a été utilisée avec succès pour plusieurs protéines de M. tuberculosis et de M. leprae. Enfin, plusieurs protéines ou fragments de protéines de l'enveloppe du virus responsable du SRAS ont été produits et purifiés dans le cadre de collaborations industrielles en vue de la mise au point d'un vaccin anti-SRAS et de tests de diagnostics de ce coronavirus.

5- Production et étude d'une protéine recombinante, candidat vaccin contre le paludisme (A. Chaffotte et A.-G. Planson)

Le fragment C-terminal F19 de la protéine MSP1 (Merozoite Surface Protein) de Plasmodium falciparum est un candidat vaccin contre le paludisme. Nous cherchons à le faire produire en quantités importantes et à bas prix par la bactérie E. coli . La comparaison des caractéristiques structurale (par RMN) du fragment F19 exprimé dans le périplasme de E. coli, soit à l'état individuel, soit sous forme fusionnée à l'extrémité C-terminale de MalE, a permis de mettre en évidence une propriété remarquable de MalE en tant qu'assistant au repliement oxydatif de F19 au sein de la fusion. Afin de déterminer si cet effet d'assistance est en relation avec le contexte d'expression, nous avons examiné les propriétés de repliement in vitro de la fusion MalE-F19. L'étude cinétique du repliement de la fusion a montré un ralentissement important de la phase observable la plus précoce du repliement de la partie MalE, que la région F19 soit ou non réduite. La cinétique de repliement en conditions oxydantes de la fusion préalablement dénaturée et réduite, conduit à son terme à la restitution des épitopes de F19 ainsi qu'en témoigne le regain de son immunoréactivité vis-à-vis d'anticorps monoclonaux spécifiques du fragment natif. La caractérisation structurale par RMN (en collaboration avec Inaki Guijarro, Unité de RMN des Biomolécules) du fragment isolé après renaturation de la fusion, a montré que F19 se replie dans son format natif : les spectres TOCSY et NOESY se superposent parfaitement aux spectres correspondants du fragment natif (=non dénaturé). Ce résultat montre que l'effet d'assistance de MalE au repliement oxydatif du fragment est intrinsèque et n'implique pas le contexte d'expression de la fusion MalE-F19.

6- Cinétique de repliement de HasA en présence de SecB (A. Chaffotte et C. Bodenreider)

Des études cinétiques détaillées, réalisées à l'aide du stopped-flow en collaboration avec N. Wolff (Unité de RMN des Biomolécules) et P. Delepelaire (Unité des Membranes Bactériennes), ont montré que la présence du chaperon SecB ralentit fortement le repliement de la protéine HasA, hémophore extracellulaire de S. marcescens. Ces études mettent en évidence le rôle de SecB au cours du processus de sécrétion de HasA par le transporteur ABC.

7- Participation aux activités de la plateforme technologique de Biophysique des Macromolécules Biologiques (A. Chaffotte, M. Goldberg, R. Nageotte)

L'unité assure la réalisation technique et la supervision scientifique (aide à la conception et à l'interpréation) des expériences de dichroisme circulaire, de spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier et d'ultracentrifugation analytique, réalisées dans le cadre de la plateforme technologique. Elle assure l'hébergement et le contrôle de maintenace des équipements correspondants.

8- Enseignement

L'Unité a la charge de l'organisation du Cours de Biochimie des Protéines (co-Directeurs A. Chaffotte et J-M. Betton) de l'Institut Pasteur associé au DEA de "Structure, Fonction et Ingénierie des Protéines (Paris 6/ Paris 7/ Paris11/ ENS/ Polytechnique/ CEA), et plusieurs membres de l'Unité ont participé aux travaux pratiques de ce cours en 2003.

Légende :

Figure 1: Test de spécificité des anticorps anti-PrP

1 microlitre d'extrait cellulaire ou de suspension de prion a été déposé en 5 points selon la disposition suivante: en haut, cellules non productrices de PrP; à droite, cellules productrices de PrP glycosylée; en bas, cellules productrices de PrP non-glycosylée; à gauche, prions glycosylés structurés; au centre, prions glycosylés déstructurés par chauffage à 95°C en urée 3M.

Une tâche noire indique une forte réactivité; l'absence de tâche indique une réactivité faible ou nulle.

Mots-clés: Prion, déglycosylation, chaperon moléculaire, repliement, réponse aux stress



  publications

puce Toutes les publications 2003 sur notre base de données


  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  LENOIR Lucile (llenoir@pasteur.fr) BENAROUDJ Nadia, IP, Chargée de Recherche (nbena@pasteur.fr)

BETTON Jean-Michel, CNRS, Directeur de Recherche 2 (jmbetton@pasteur.fr)

CHAFFOTTE Alain-François, IP, Chef de Laboratoire (chaffott@pasteur.fr)

FALANGA Pierre, IP, Chargé de Recherche (pfalanga@pasteur.fr)

GOLDBERG Michel, IP, Professeur (goldberg@pasteur.fr)

HONTEBEYRIE-JOSKOWICZ Mireille, IP, Chef de Laboratoire (mhj@pasteur.fr)
BITTOUN Patrick, IP, Chercheur post-doctoral (pbittoun@pasteur.fr)

CARDONA Muriel, Chercheur contractuel (mbernard@pasteur.fr)

JACKOWSKI Ula, Univ. of Berkeley, USA, Etudiante

MIOT Marie-Caroline, UP7, Doctorante (mmiot@pasteur.fr)

NOIREL Josselin, UP7, DEA

PLANSON Anne-Gaëlle, UP7, Doctorante (planson@pasteur.fr)
BLOM-POTAR Marie-Christine, IP, Ingénieur (mcpotar@pasteur.fr)

CUCHE Céline, IP, Technicienne (ccuche@pasteur.fr)

NAGEOTTE Roland, IP, Ingénieur (nageotte@pasteur.fr)

ROGE Julie, CDD IP, Ingénieur (jroge@pasteur.fr)

SASSOON-CLAVIER Nathalie, IP, Technicienne (nsassoon@pasteur.fr)

LENOIR Lucile, IP, Secrétaire (llenoir@pasteur.fr)

NGUYEN Huuu-Huan, IP, Agent de Laboratoire

NINO Marguerite, IP, Agent de Laboratoire

TOMMASINO Patrice, IP, Agent de Laboratoire


Rapports d'activité 2003 - Institut Pasteur
filet

Debut de Page recherche Portail Institut Pasteur

En cas de problèmes, de remarques, ou de questions concernant cette page Web écrire à rescom@pasteur.fr