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     Bactéries anaérobies et Toxines


  Responsable : Popoff Michel R. (mpopoff@pasteur.fr)


  resume

 

Etude de la régulation de la toxinogénèse chez Clostridium botulinum et Clostridium tetani, analyse de la fonction des protéines régulatrices BotR et TetR, analyse des systèmes de régulation à deux composants. Etude des toxines clostridiennes de grande taille (toxines de C. sordellii) qui glucosylent des GTPases Rho et Ras, analyse de l'apoptose et des voies de signalisation régulant le cytosquelette d'actine et les jonctions intercellulaires. Effets de la toxine epsilon sur les barrières cellulaires.

Le CNR Bactéries anaérobies et botulisme est impliqué dans la surveillance du botulisme et l'identification des souches de bactéries anaérobies (voir ).



  rapport

cale

Travaux de recherche sur le botulisme

Etude de la régulation de la toxinogénèse chez C. botulinum

Les neurotoxines botuliques (150 kDa) sont associées de façon non covalente à d'autres protéines non toxiques (appelés "associated non toxic protein" ANTP) pour former des complexes de grande taille (300 à 900 kDa). Les gènes codant pour la neurotoxine botulique et les ANTPs sont groupés sur un segment d'ADN dénommé locus botulique. Ils sont organisés en deux opérons, l'un contient les gènes de la neurotoxine botulique précédé de celui codant pour la protéine non toxique et non hémaglutinante (NTNH), et le deuxième correspond aux gènes des trois protéines hémaglutinantes (HA). Un cinquième gène code pour une protéine (BotR) qui possède les propriétés d'une protéine se liant à l'ADN, est localisé en partie 5' du locus botulique ches C. botulinum C et D et entre les deux opérons chez C. botulinum A et B. Ce gène est également conservé chez C. tetani (tetR). Nous avons montré dans un travail précédent que BotR/A est un régulateur positif de l'expression des gènes de la neurotoxine botulique et des ANTPs, par construction d'une souche de C. botulinum A qui surexprimait le gène botR/A ou de souches chez lesquelles la production de ce gène était inhibée par un système d'ARN messager antisens. BotR/A de C. botulinum A a été produite en tant que protéine recombinante avec un tag de six histidines chez Escherichia coli, et a été purifiée par chromatographie d'affinité. BotR/A purifié ainsi que des lysats de C. botulinum A surexprimant BotR/A ont été testés en gel retard avec l'ADN des régions promotrices des deux opérons. Des retards de migration électrophorétique des ADN testés ont été observés en présence des lysats de C. botulinum A mais pas avec BotR/A purifiée. Par contre, BotR/A en présence de core enzyme de la RNA polymerase de E. coli induit des retards de migration indiquant que BotR serait un facteur sigma alternatif de la même famille que TxeR de Clostridium difficile. La liaison du complexe BotR/A-core enzyme de la RNA polymerase s'observe principalement avec les ADN des régions promotrices des deux opérons du locus botulique et plus faiblement avec les promoteurs des gènes internes signifiant que les gènes de la neurotoxine botulique A et des ANTPs sont exprimés essentiellement sous forme polycistronique.

Passage de la barrière intestinale par la toxine botulique A

Les cellules intestinales CaCo-2 cultivées sur filtre forment des monocouches de cellules polarisées avec constitution des jonctions intercellulaires. BoNT/A purifiée ou sous forme de complexe, a été inoculée du côté apical des cellules. Le passage de la neurotoxine a été évalué en déterminant la dose létale (DL50) par titrage chez la souris. L'intégrité de la monocouche cellulaire, suivie par mesure de la résistance électrique transépithéliale et visualisation en immunofluoresence de l'actine, des jonctions apicales (ZO1) et basolatérales (E-cadhérine), n'a pas été modifiée au cours du traitement par les toxines. La neurotoxine botulique A seule est capable de traverser une monocouche de cellules CaCo-2 (passage de 1 à 5%), mais son passage est amélioré lorsque la neurotoxine est sous forme de complexe. Ce passage intervient à 37°C et est bloqué à 4°C. De plus, il est saturable dans un délai de 20-30 min. Ceci indique qu'il s'agirait d'un processus d'endocytose-transcytose médié par récepteur. Ce mode de transport de la neurotoxine botulique à travers les monocouches de cellules polarisées est en cours d'étude.

La toxine létale de C. sordellii conduit à la mort par apoptose des cellules myéloïdes humaines (HL-60)

C'est parce qu'elles synthétisent une toxine, la toxine létale (LT), que certaines souches de Clostridium sordellii sont pathogènes. LT est une protéine de grande taille (250 kDa) qui pénètre dans les cellules ; elle possède une activité glucosyle-transférase qui va conduire à la glucosylation de différentes petites protéines G et ainsi les inactiver. La toxine LT de la souche IP82 a comme cibles principales la protéine Rac de la famille Rho qui agit sur la polymérisation de l'actine, et les protéines de la famille Ras, Ras, Rap et Ral. LT de la souche 9048 inactive également Cdc42 mais pas Ral.

En étudiant l'effet de LT-IP82 sur la phospholipase D, une enzyme régulée par différentes petites protéines G dont les protéines de la famille Rho et la protéine Ral, nous avons observé que des cellules myéloïdes humaines (la lignée HL-60) mouraient par apoptose. La mort par apoptose a été confirmée par différents tests : condensation de la chromatine, nucléaire, échelle caractéristique de l'ADN, fixation par les cellules vivantes de l'annexine V reflétant l'exposition de la phosphatidylsérine à la surface d la membrane plasmique. Nous avons démontré que pour induire l'apoptose, la toxine LT agissait au niveau mitochondriale, ceci a été montré par l'effet de la toxine qui diminue le potentiel de membrane mitochondriale et par une étude sur la cinétique d'activation des caspases établissant que LT active la caspase 9 avant la caspase 8. Un argument supplémentaire est l'observation que des cellules HL-60 qui surexpriment la protéine anti-apoptotique Bcl-2 protégeant la mitochondrie, ne sont pas tuées par LT-IP82. Enfin, nous avons observé que LT se localisait, au moins partiellement, au niveau mitochondriale (Fig. 1).

Nous avons tenté de savoir si la mort par apoptose provoquée par LT-IP82 pouvait être liée à l'inactivation d'une petite protéine G. Il semble bien que les modifications du cytosquelette d'actine, conséquence de l'inactivation de Rac, ne soient pas à l'origine de la mort par apoptose car d'autres toxines qui provoquent des modifications semblables, comme la toxine iota (ia-ib) de C. perfringens ou la cytochalasine B, ne conduisent pas à la mort par apoptose. Par contre, nous avons observé que la toxine létale, LT9048, utilisée aux mêmes concentrations que LT-IP82, n'induit pas l'apoptose des cellules HL-60. Cette toxine provient d'un variant de C. sordellii, elle n'a pas tout à fait les mêmes cibles que LT-IP82. Elle inactive Cdc42, une autre petite G de la famille Rho qui agit aussi sur le cytosquelette d'actine, mais n'inactive pas Ral, ce qui suggère que Ral pourrait être essentielle dans l'orientation de la cellule vers la survie ou la mort par apoptose. Reste à prouver que l'effet apoptotique de LT est bien lié à son activité glucosyle-transférase qui conduit à l'inactivation de petites protéines G.

Toxines de Clostridium qui modifient les barrières cellulaires

Certains Clostridium produisent de puissantes toxines agissant sur les barrières cellulaires, telles que épithélium intestinal ou rénal, qui constituent la première ligne de défense des organismes contre l'invasion bactérienne. Un modèle de barrière cellulaire est obtenu en cultivant des cellules en monocouche sur des filtres.

La toxine epsilon produite par C. perfringens B et D est responsable de sévères entérotoxémies chez les animaux, et elle est également susceptible de causer de graves lésions chez l'homme. Dans un premier temps, nous avons montré que la toxine epsilon s'associe avec un récepteur présent à la surface de cellules rénales de chien (lignée MDCK) en formant un complexe très stable de grande taille qui correspond à l'oligomérisation de la toxine et à la formation de pores. Il s'en suit une fuite de K+, une augmentation de Na+ et Cl- intracellulaires, et une mort rapide de la cellule mesurable par le test de viabilité cellulaire dépendant de l'intégrité des mitochondries (MTT). La toxine epsilon permet également l'entrée d'iodure de propidium dans les cellules de façon parallèle à la mort cellulaire, indiquant que cette toxine forme des pores de grand diamètre. A l'aide de couches lipidiques artificielles, nous avons montré que la toxine epsilon induit des pores non sélectifs perméables aux solutés hydrophiles de masse moléculaire inférieure à 1 kDa.

La toxine epsilon augmente de façon très rapide et sévère la perméabilité des monocouches de cellules MDCK cultivées sur filtre. Cette activité a été reliée à la formation de pores dans les membranes cellulaires. La toxine epsilon se fixe soit sur la face apicale soit sur la face basolatérale des cellules, mais elle n'a pas été visualisée dans des compartiments internes (Fig. 2). Le cytosquelette d'actine, les jonctions intercellulaires et la perméabilité para-cellulaire ne sont pas directement modifiés par la toxine.

Les toxines clostridiennes de grande taille telles que les toxines A et B de C. difficile et LT de C. sordellii glucosylent des protéines G de la famille Rho et Ras et ainsi modifient le cytosquelette d'actine. L'étude de la toxine LT sur le cytosquelette d'actine et les jonctions intercellulaires de monocouches de cellules intestinales cultivées sur filtre est en cours.

Légendes :

Figure 1. Les cellules promyélocytaires humaines, HL 60, sont traitées par la toxine LT-IP82 (100ng/ml) pendant différents temps, puis fixées avec 2% de PFA. La localisation de la toxine LT au niveau des mitochondries a été recherchée par microscopie confocale en utilisant un anticorps polyclonal contre la partie N-term de LT et un anticorps monoclonal (MAB 1273) contre une protéine mitochondriale.

Figure 2. Localisation cellulaire de la toxine epsilon sur des cellules MDCK polarisées cultivées sur filtre. La toxine epsilon a été incubée soit du coté apical (A) soit du coté basolatéral (B) des cellules. Les cellules ont été fixées et révélées avec des anticorps fluorescents anti-toxine et observées en microscopie confocale. Notez l'immunomarquage de la toxine epsilon sur la face correspondant à celle où a été incubée la toxine et l'absence de marquage intracellulaire.

Mots-clés: Clostridium, botulisme, toxines, Rho-GTPases, apoptose



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