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     Apoptose et système immunitaire - CNRS URA 1961


  Responsable : SUSIN, Santos A. (susin@pasteur.fr)


  resume

 

La mort cellulaire programmée (MCP) ou apoptose fait partie intégrante de la physiologie normale d'un organisme. Une dérégulation de la MCP peut-être à l'origine de nombreuses pathologies (cancers, maladies neurodégénératives et auto-immunes). Dans de nombreux modèles, ce processus hautement contrôlé est lié à l'activation d'une famille de protéases à cystéine, les caspases. Mais de nombreuses données se sont accumulées en faveur de l'existence de diverses voies de mort caspase-indépendantes. L'équipe Apoptose et Système Immunitaire se consacre à l'étude des mécanismes de la mort cellulaire indépendante des caspases dans le contexte du système immunitaire, à travers un projet de recherche visant deux objectifs majeurs: 1) Identifier les mécanismes qui régulent la mort cellulaire "nécrose-like" médiée par CD47 dans la leucémie lymphoïde chronique B; 2) Définir les mécanismes moléculaires qui déterminent les fonctions de AIF (un des agents essentiels de l'apoptose caspase-indépendante) et approfondir les connaissances du mécanisme de régulation cellulaire de la mort "apoptose-like".



  rapport

cale

Identification des mécanismes qui régulent la mort cellulaire "nécrose-like" médiée par CD47 dans la leucémie lymphoïde chronique B (Marlène Bras, Nadine Robert & Gaël Roué).

L'engagement de l'antigène CD47 (IAP) par son ligand physiologique, la thrombospondine, ou par un anticorps agoniste anti-CD47 mimant les effets du ligand, induit l'adhésion et la mobilité des cellules via les intégrines-ß3 auxquelles le récepteur est associé, mais aussi une forme de mort cellulaire indépendante des caspases dont le mécanisme reste à déterminer. A travers une analyse cellulaire multi-paramétrique, notre objectif est d'identifier les acteurs impliqués dans la transduction de ce signal de mort dans le contexte de la leucémie lymphoïde chronique B (LLC-B). En effet, alors que le système CD47 est physiologiquement impliqué dans l'élimination des lymphocytes B et T, la fonctionnalité de cette voie de mort est conservée dans les cellules de LLC-B alors que celles-ci se montrent résistantes à l'apoptose médiée par la voie intrinsèque mitochondriale (activée par la plupart des agents utilisés en chimiothérapie) et par la voie extrinsèque des récepteurs de mort.

En induisant la mort des cellules B de LLC-B par l'anti-CD47, nous n'observons pas de modification de la morphologie nucléaire, d'hypodiploïdie, ou de fragmentation de l'ADN, malgré la chute du potentiel membranaire mitochondrial, la production de radicaux libres oxygénés et l'exposition des résidus de phosphatidylsérine à la couche externe de la membrane plasmique. De plus, en aval de la mitochondrie, nous n'observons pas de relargage du cytochrome c ou de AIF ni d'activation de la caspase-3. Par comparaison, lors d'un traitement des cellules de LLC-B par l'hydrocortisone, un glucocorticoïde auquel ces cellules sont restées sensibles, la mort cellulaire est accompagnée de tous les signes de l'altération du potentiel mitochondrial et de la fragmentation de l'ADN nucléaire due à l'activité des caspases. Dans ce cas de figure, le cytochrome c et AIF se trouvent bien remobilisés, et la caspase-3 est activée. Tous ces phénomènes sont alors dépendants de l'activité des caspases et ne sont plus observés en présence de l'inhibiteur général de caspases z-VAD.fmk. En revanche, la mort induite par CD47 reste indépendante de ces protéases et n'est pas inhibée par le z-VAD.fmk. L'ensemble de ces paramètres nous permettent d'identifier la mort cellulaire médiée par CD47 comme une mort de type "nécrose-like".

Afin d'identifier les éléments de cette voie de mort, nous avons tout d'abord cherché à déterminer par cytométrie en flux et immunofluorescence le niveau d'activation de deux protéines pro-apoptotiques de la famille Bcl-2 : Bax et Bak. Nous observons par cette technique que ces deux protéines se retrouvent activées dans cette voie de mort, et ceci de manière encore plus importante que lors du traitement par l'hydrocortisone. Ces résultats ont été confirmés dans la lignée leucémique T Jurkat, avec pour contrôle un traitement par l'étoposide, un inhibiteur de la topoisomérase II.

Nous étudions actuellement le rôle de l'activation de Bax et Bak dans cette voie de mort, à partir de cellules invalidées pour Bax et/ou Bak. En parallèle, nous étudions le rôle éventuel des protéines à domaine BH3 telles que Bid, Bim, ou Bmf, potentiellement impliquées dans l'activation de Bax et Bak. Enfin, par l'utilisation de différents inhibiteurs spécifiques, nous cherchons à caractériser les évènements qui précèdent l'activation de Bax, Bak et le signal mitochondrial.

II. Approfondissement des connaissances de la régulation cellulaire de la mort "apoptose-like" (Cécile Delettre-Cribaillet, Rana Moubarak & Victor J. Yuste-Mateos)

Un des agents essentiels de l'apoptose caspase-indépendante est la protéine AIF (ou "Apoptosis Inducing Factor"). AIF est une protéine mitochondriale possédant à la fois une fonction oxydo-réductase et une fonction apoptotique. Bien que ces fonctions aient été déjà caractérisées, de nombreuses questions relatives au mode d'action de la protéine restent encore sans réponse.

L'objectif de notre projet est ainsi de définir les mécanismes moléculaires qui déterminent les fonctions de AIF et d'approfondir les connaissances du mécanisme de régulation cellulaire de la mort caspase-indépendante "apoptose-like" et du rôle de AIF dans cette régulation.

-Caractérisation des isoformes de AIF: Il existe deux isoformes de AIF issues respectivement de l'épissage alternatif de l'exon 2 (variant 1) et de l'exon 2b (variant 2). Afin de mieux comprendre leur rôle dans le processus d'apoptose caspase-indépendante, nous avons caractérisé leur distribution tissulaire chez l'homme par RT-PCR et Northern blot. Les deux variants montrent une expression tissulaire différentiell. Nous procédons actuellement à une caractérisation plus précisé de ces deux isoformes, ainsi que de leurs fonctions dans la mort cellulaire caspase-indépendante.

-Identification des facteurs qui interagissent avec AIF avant et après un stimulus apoptotique: À partir d'une construction AIF-FLAG et à l'aide d'expériences d'immunoprécipitation, nous avons obtenu, en collaboration avec la plate-forme de protéomique de l'Institut Pasteur, les séquences de plusieurs protéines potentiellement partenaires de AIF. Des études de liaisons entre ces protéines et AIF seront effectuées afin de démontrer leurs interactions potentielles. Les données ainsi obtenues seront complétées par des expériences fonctionnelles qui nous permettront de sélectionner de potentiels cofacteurs d'AIF.

-Élimination de AIF par la technique de RNAi, effets sur l'apoptose : La technique de RNAi (RNA interférence) permet de diminuer l'expression d'une protéine au moyen de l'introduction dans la cellule d'un petit ARN de double chaîne, spécifique de l'ARN messager à détruire. Nous avons dessiné des siRNA (short interference RNA) de 19 nucléotides qui correspondent à la région 5' de l'ARN messager de AIF. Après la transfection de ces oligonucléotides dans des cellules HeLa, nous avons pu observer par Western blot et par immunofluorescence une diminution de 80% de l'expression de AIF. Après la confirmation de ces résultats par RT-PCR, nous travaillons actuellement sur les voies de signalisation de l'apoptose qui pourraient être affectées par la diminution du niveau d'expression de AIF.

-Activité anti-tumorale de AIF : Dans le but d'approfondir l'implication de AIF dans les cancers, nous étudions également l'expression de la protéine dans différentes lignées cellulaires tumorales traitées avec des inducteurs de stress oxydatif, des agents chimiothérapeutiques ou par irradiation. Nous cherchons actuellement à démontrer le lien de cause à effet entre déficit d'AIF et oncogénèse.

L'ensemble de ces travaux permettra d'approfondir la connaissance des mécanismes moléculaires qui caractérisent la mort "apoptose-like". Les résultats obtenus fourniront les données nécessaires pour connaître les partenaires de AIF et permettront aussi d'évaluer l'implication de AIF dans le développement des tumeurs et de déterminer s'il peut être un marqueur diagnostique et pronostique des cancers.

Légendes

1. Distribution subcellulaire des protéines proapoptotiques cytochrome c et AIF dans les cellules B de LLC-B traitées avec hydrocortisone ou avec un anticorps anti-CD47 immobilisé.

2. Modifications morphologiques induites par AIF dans les noyaux des cellules Hela.

Mots-clés: Apoptose, Apoptosis Inducing Factor (AIF), Cancer, LLC-B, Mort caspase-indépendante



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  AYTAC, Marie-Dominique, (mdaytac@pasteur.fr) SUSIN, Santos A., CNRS, (CR1, susin@pasteur.fr) DELETTRE-CRIBAILLET, Cécile, Chercheur post-doctoral

ROUÉ, Gaël, Chercheur post-doctoral

YUSTE-MATEOS, Victor J., Chercheur post-doctoral

BRAS, Marlène, Étudiante en thèse

MOUBARAK, Rana, Étudiante en thèse
ROBERT, Nadine (Technicienne, nadou@pasteur.fr)

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