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Version PDF      Pathogénie Bactérienne des Muqueuses


  Responsable : LABIGNE Agnès (alabigne@pasteur.fr)


  resume

 

Les travaux de l'Unité portent sur l'étude du pouvoir pathogène de bactéries colonisant les muqueuses : Helicobacter pylori qui est impliquée dans la genèse des pathologies gastro-duodénales inflammatoires (gastrites chroniques, ulcères peptiques, cancers gastriques et lymphome de MALT), les bactéries du genre Helicobacter associées aux maladies inflammatoires chroniques intestinales (MICI) et les Escherichia coli pathogènes qui sont associés à des diarrhées et des infections extra-intestinales (infections urinaires, méningites, septicémies). Génomique fonctionnelle et comparative, études des interactions des bactéries avec les cellules épithéliales et les cellules immunitaires, ainsi que des voies de signalisation qu'elles induisent, analyse des réponses immunitaires associées aux infections, caractérisation des lésions génotoxiques associées au processus inflammatoire, identification de nouvelles cibles thérapeutiques et prophylactiques, études épidémiologiques figurent parmi les approches mises en œuvres pour l'étude de ces pathogènes des muqueuses.



  rapport

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Bactéries du genre Helicobacter

La prévalence des infections à H. pylori est extrêmement importante puisqu'elle atteint 30 % de la population dans les pays industrialisés et 80 à 95 % dans les pays en voie de développement. C'est très probablement l'infection bactérienne la plus répandue à la surface du globe et les pathologies sévères qu'elle induit constituent un enjeu économique de première importance : rappelons que 10 % de la population dans nos pays souffrent d'ulcères peptiques, et que l'on estime, sur la base de données récentes, que 1 % des personnes infectées par H. pylori développeront un cancer gastrique.

Notre activité s'organise donc autour de ce thème selon plusieurs grands axes : A) une recherche fondamentale qui se fixe pour objectif de comprendre les mécanismes qui permettent à H. pylori de survivre, de coloniser, de persister et de générer des lésions. B) Une recherche plus appliquée avec des enjeux épidémiologiques (étude du mode de transmission des souches au sein des familles), cliniques (réponse immunitaire à l'infection, suivi thérapeutique), diagnostiques (association de marqueurs prédictifs), mais surtout des enjeux thérapeutiques (étude des voies de biosynthèses du peptidoglycane — définition de régions d'interactions entre protéines essentielles) et préventifs.

Adaptation à l'environnement gastrique et virulence chez H. pylori (Stéphanie BURY-MONE et Hilde DE REUSE)

H. pylori est une bactérie capable de survivre et de proliférer dans l'estomac humain, un environnement acide particulièrement hostile. Cette capacité exceptionnelle à résister et à s'adapter aux stress rencontrés lors de la colonisation de son hôte est intimement liée à la virulence de ce pathogène. H. pylori possède des mécanismes originaux de résistance à l'acidité qui dépendent en grande partie de sa capacité à produire d'importantes quantités d'ammoniac lui permettant de maintenir un pH intracellulaire proche de la neutralité. L'ammoniac a de plus un rôle dans la genèse des lésions. Nous étudions différentes voies de production de l'ammoniac chez H. pylori. La première voie dépend de l'hydrolyse de l'urée par l'uréase et de la protéine UreI qui constitue un nouveau type de canal à urée activé à pH acide. Nous avons récemment démontré une complémentation hétérologue entre la protéine UreI et un transporteur d'urée de type eucaryote de la bactérie Yersinia pseudotuberculosis. La seconde voie de production d'ammoniac dépend de l'activité de deux amidases aliphatiques dont nous avons caractérisé les rôles in vitro et in vivo. Ces enzymes sont retrouvées dans différentes bactéries du genre Helicobacter capables de coloniser l'estomac et ont très probablement été acquises par transfert horizontal. Des approches génétiques ciblées (construction de mutants de gènes candidats) et des approches de génomique fonctionnelle (transcriptome) sont poursuivies pour identifier d'autres facteurs impliqués dans la résistance à l'acidité (extrême ou modérée) chez H. pylori. De nombreux gènes dont l'expression est contrôlée par l'acidité ont ainsi été identifiés. Le rôle de leurs produits dans la résistance aux bas pH est examiné in vitro et dans un modèle animal à l'aide de souches mutantes. Ces études devraient nous permettre d'identifier des nouveaux mécanismes impliqués dans la résistance à l'acidité chez H. pylori et d'évaluer leur importance dans la virulence de ce pathogène.

Génomique comparative : étude de la distribution des ORFs de H. pylori au sein des isolats cliniques par hybridation sur membranes à haute densité (Jean-Michel THIBERGE et Agnès LABIGNE en collaboration avec la plateforme génomique IP et le GEFH, Groupe d'Etude Francophone des Helicobacter)

L'étude de la distribution des 1590 ORFs du génome de l'une des souches séquencées de H. pylori au sein de souches provenant de patients d'origines ethniques différentes a permis l'identification de 242 ORFs non ubiquitaires c'est-à-dire absentes de certaines souches. Trois cents membranes à haute densité contenant ces 242 ORFs non ubiquitaires plus 50 ORFs présentes dans toutes les souches ont été préparées et leur utilisation validée. Ces membranes font l'objet d'études multicentriques visant à étudier la distribution des ORFs en fonction de l'origine géographique des souches et à rechercher l'éventuelle association de certaines d'entre elles à des pathologies de diverse sévérité (gastrite, ulcère, lymphome de MALT et métaplasie intestinale). L'analyse des résultats d'hybridation en composantes principales (ACP) permet d'observer le regroupement de souches associées à une même pathologie.

Analyse fonctionnelle : détermination du caractère essentiel d'une sélection de gènes (Chantal ECOBICHON, et Agnès LABIGNE)

Deux banques génomiques ont été construites chez E. coli : une banque contenant individuellement toutes les ORFs clonées de H. pylori, et une deuxième banque contenant pour chacune des ORFs un pool de plasmides dans lesquels ces ORFs sont interrompues par insertion d'un transposon. A partir de ces outils génomiques, nous cherchons à identifier les gènes ubiquistes dans l'espèce qui sont de plus essentiels à la viabilité de la bactérie. Ces caractéristiques ont d'ores et déjà été assignées à 44 des 316 gènes analysés individuellement. Par ailleurs, parmi les 210 gènes spécifiques à H. pylori et ubiquistes, 155 ont été analysés ; 15 possèdent les caractéristiques de gènes spécifiques à Helicobacter pylori, sont à la fois ubiquistes et essentiels et codent donc pour des protéines représentant des cibles thérapeutiques potentielles.

Etude des gènes de réparation de l'ADN chez H. pylori (Catherine CHEVALIER et Agnès LABIGNE en collaboration avec Pablo RADICELLA du C.E.A. Fontenay aux Roses)

L'objectif de ce projet est d'identifier et de caractériser les systèmes de réparation de l'ADN chez H. pylori ainsi que d'évaluer leur impact sur la variabilité génétique au sein de cette espèce. Les gènes codant pour des protéines potentiellement impliquées dans la réparation ont été inactivés. Les propriétés hyper- ou hypo-mutatrices des simples ou doubles mutants construits ont été mesurées, et leur capacité à coloniser la souris testée. L'EndoIII réelle (réparation des pyrimidines oxydées, HP0585) joue un rôle critique dans la persistance de l'infection.

Etude de la génotoxicité induite par l'infection à H. pylori sur la muqueuse gastrique dans un modèle de souris transgéniques (Eliette TOUATI, Valérie MICHEL, Jean-Michel THIBERGE et Agnès LABIGNE, en collaboration avec Michel HUERRE, thème faisant l'objet d'un PTR coordonné par E. TOUATI)

Le modèle de souris transgéniques " Big Blue " s'est avéré un outil puissant pour quantifier les effets génotoxiques des infections à H. pylori au niveau de la muqueuse gastrique. Après 6 mois d'infection, la fréquence de mutants mesurée au niveau de l'épithélium gastrique est induite d'un facteur 4 dans le groupe de souris infectées par H. pylori, comparé aux témoins non-infectés. L'analyse du spectre de mutations induites montre des évènements reflétant les dommages oxydatifs préalables de l'ADN (transversions GC->TA et AT->CG). Cet effet mutagène s'accompagne de l'induction de l'expression de la nitric oxide synthase (iNOS), responsable de la production d'une forte quantité de NO•. A partir de ce modèle, nous désirons déterminer les évènements précoces à l'origine du processus de cancérogenèse, ainsi que quantifier les effets génotoxiques associés à différents facteurs de risques bactériens, de l'hôte ou environnementaux jouant un rôle dans la relation entre l'infection par H. pylori et le développement du cancer gastrique.

H. pylori comme modèle d'étude du métabolisme de l'étape d'assemblage du peptidoglycane (Ivo G. BONECA et Catherine CHAPUT)

Comparé aux autres bactéries, H. pylori semble posséder un nombre limité de gènes impliqués dans les voies requises pour la biosynthèse d'un peptidoglycane fonctionnel. Les études menées visent à caractériser les hydrolases (AmiA, Slt, MltD) et les trois synthétases (PBPs 1, 2 and 3) qui sont impliquées dans la dernière étape d'assemblage du peptidoglycane au niveau de l'espace périplasmique et qui jouent un rôle central dans le mode d'action des béta-lactamimes. Mieux comprendre comment la bactérie répond aux antibiotiques et comment elle module la synthèse de son peptidoglycane apparaît primordial pour le développement de nouvelles molécules anti-microbiennes. Des mutants simples affectés dans la synthèse des hydrolases ont été construits et des hydrolases recombinantes ont été produites pour confirmer les fonctions de ces protéines. AmiA joue un rôle majeur dans les étapes tardives de la division cellulaire, alors que la protéine Slt est impliquée dans la croissance de la bactérie dans certaines conditions. C'est, à notre connaissance, la première démonstration du caractère essentiel des hydrolases pour la croissance bactérienne.

La base de donnée PyloriGene : actualisation et exploitation de l'annotation des deux séquences génomiques de H. pylori. (Ivo G. BONECA, Hilde DE REUSE, Agnès LABIGNE)

Nous cherchons à mettre à la disposition de la communauté scientifique une base de données génomiques de H. pylori qui soit la plus informative possible (annotations physiques et biologiques, références bibliographiques). La mise à jour de l'annotation prend en compte (i) la littérature récente relative à H. pylori, (ii) les données provenant d'autres organismes et, (iii) les sources d'erreur d'annotation physique du génome. Ces différences d'annotations physiques entre les deux génomes sont dues, entre autres, à des erreurs de séquençage, des problèmes d'attribution de codons d'initiation de la traduction et, dans certains cas, ont révélé de nouveaux gènes régulés par décalage de phase de lecture. Nous avons ainsi pu améliorer la prédiction de fonctions pour des protéines inconnues et réassigner des nouvelles fonctions à des protéines déjà annotées.

Reconnaissance de H. pylori par les cellules épithéliales gastriques et voies de signalisation induites (Catherine CHAPUT, Ivo BONECA, Richard FERRERO en collaboration avec Jérôme VIALA et Dana PHILPOTT ; thème faisant l'objet d'un PTR)

Les souches de H. pylori qui possèdent un îlot de pathogénicité cag induisent l'activation de réponses pro-inflammatoires dans les cellules épithéliales gastriques. L'objectif de ce travail est de comprendre comment des cellules épithéliales gastriques sont capables de reconnaître et de répondre à un pathogène par essence extracellulaire comme H. pylori. Nous tentons d'identifier la(les) molécule(s) bactériennes(s) responsable(s) du déclenchement des réponses inflammatoires et d'identifier le(s) récepteur(s) permettant à la cellule hôte de répondre à cette agression bactérienne.

Le rôle des macrophages dans l'inflammation chronique induite par H. pylori (Alain GOBERT et Richard FERRERO)

Les interactions de H. pylori avec les cellules phagocytaires sont encore mal connues, bien que ces populations cellulaire jouent un rôle très important dans le maintien de l'inflammation chronique. Nous avons montré que les souches de H. pylori induisent la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires et du monoxyde d'azote dans les surnageants de culture de macrophages murins. Bien que ces réponses soient dépendantes de la voie d'activation du facteur transcriptionnel NF-kappaB, il semble que les voies de signalisation amenant à la fois à la synthèse de cytokines et à la production de monoxyde d'azote soient distinctes. Nous poursuivons l'analyse des voies de signalisation impliquées dans la production de ces deux médiateurs de l'inflammation. Un objectif important du travail est l'identification du ou des facteur(s) sécrété(s) et/ou relargué(s) par les bactéries qui sont à l'origine de l'induction d'une synthèse d'IL-6 dans les macrophages.

Modulation des réponses inflammatoires intestinales lors de l'infection par les bactéries du genre Helicobacter (Nadia CHAOUCHE et Richard FERRERO). Les bactéries du genre Helicobacter qui colonisent naturellement l'intestin de la souris sont responsables de la genèse de lésions inflammatoires intestinales ; ces infections constituent un modèle expérimental d'étude des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) chez l'homme. Nous avons démontré la capacité des bactéries du genre Helicobacter à induire des réponses pro-inflammatoires dans des lignées épithéliales d'origine intestinale. Il s'avère que certaines de ces bactéries sont également capables de modifier la fonction de barrière de cellules polarisées.

ESCHERICHIA COLI PATHOGÈNES

Les souches pathogènes de Escherichia coli sont à l'origine d'une grande partie des infections intestinales et extra-intestinales causées chez l'homme par des bactéries. D'après l'Organisation Mondiale de la Santé, E. coli est la principale cause de diarrhée bactérienne dans le monde. E. coli est, par ailleurs, impliqué dans 90 % des infections du tractus urinaire, est considéré comme la seconde cause de méningites néonatales et est fréquemment responsable de septicémies. Notre objectif est de mieux comprendre les processus conduisant au développement de ces différents types d'infections.

Identification et caractérisation de facteurs de virulence chez les E. coli entéroagrégatifs (Christine BERNIER, Maryline DELATTRE, et Chantal LE BOUGUENEC)

Les E. coli entéroagrégatifs (EAEC) sont reconnus comme une cause émergente de diarrhées chez les enfants et les adultes partout dans le monde. Les symptômes développés par les patients et les gènes de virulence des EAEC étant très divers, le but de nos études est d'explorer cette diversité et d'augmenter notre connaissance des facteurs de virulence des EAEC en identifiant de nouvelles structures permettant l'interaction des bactéries avec les muqueuses de l'hôte. Le fimbriae AAF-III a été identifié et son rôle dans l'adhésion des bactéries aux cellules épithéliales a été caractérisé. La persistance des diarrhées à EAEC pourrait être liée à un échappement des bactéries internalisées dans des cellules intestinales aux systèmes de défenses de l'hôte. L'étude du pouvoir invasif des EAEC a montré que certaines souches étaient capables d'entrer à faible niveau dans des cellules épithéliales. L'analyse des trois fimbriae AAF connus à ce jour a permis de montrer que les composants B de ces structures présentent de grandes similitudes avec des invasines bactériennes que nous avions décrites pour les opérons AFA.

L'estimation de l'importance des EAEC dans les diarrhées bactériennes nécessite de conduire de larges études épidémiologiques. La réalisation de telles études étant difficile à cause de l'absence d'outils génétiques permettant de détecter l'ensemble des EAEC, une nouvelle sonde ADN a été développée.

Identification et caractérisation d'îlots de pathogénicité chez les E. coli (Juana ORDONEZ, et Chantal LE BOUGUENEC)

Chez les E. coli pathogènes, les gènes codant pour des facteurs de virulence sont fréquemment regroupés sur le chromosome en îlots de pathogénicité (PAI). L'identification et l'étude des PAIs permet de caractériser des gènes spécifiques des pathogènes. L'opéron afa-1 (codant pour les facteurs d'adhésion des bactéries aux cellules épithéliales) a été associé dans une souche responsable de diarrhée à une région chromosomique ayant les caractéristiques d'un PAI.

Caractérisation d'isolats cliniques humains et bovins (Laurence du MERLE, et Chantal LE BOUGUENEC)

L'étude de souches de E. coli responsables d'infections extra-intestinales a révélé la ressemblance d'isolats pathogènes humains et bovins (en collaboration avec J.P. Girardeau, INRA, Theix). L'étude de souches isolées des différents types d'infections a permis d'établir des relations phylogénétiques entre les pathovars de E. coli (en collaboration avec Erick Denamur, INSERM U458).

Génomique comparative de souches pathogènes et non pathogènes de E. coli (Laurence du MERLE, Christine BERNIER, et Chantal LE BOUGUENEC en collaboration avec Anne Marie Gilles, Evelyne Turlin, les Institut Pasteur de Dakar et Bangui et l'Institut Cantacuzène, Bucarest — P.T.R. coordonné par C. LE BOUGUENEC)

La connaissance du caractère pathogène ou non pathogène d'un isolat peut être utile aux cliniciens pour établir le diagnostic, en particulier dans le cas de pathogènes opportunistes. L'isolement d'un E. coli d'un prélèvement clinique ne peut, à lui seul, permettre de savoir si la souche est pathogène puisque des souches commensales peuvent provoquer des infections lorsque l'hôte est affaibli. L'objectif de nos travaux est d'identifier des gènes codant des fonctions conservées dans les souches pathogènes mais absentes des E. coli commensaux et d'utiliser ces données pour développer de nouveaux outils de diagnostic. Des analyses comparatives du protéome et du métabolome des souches pathogènes et commensales ont été initiées. Un grand nombre de souches pathogènes associées à différents types d'infections se sont révélées capables d'utiliser un sucre (désoxyribose) qui n'est pas métabolisé par les souches commensales de E. coli K-12. Les gènes codant cette fonction ont été identifiés et sont conservés parmi les souches pathogènes. L'acquisition de ces gènes par les souches pathogènes confère à celle-ci un avantage. Des tests génétiques et bactériologiques ont été développés pour identifier les souches de E. coli capables d'utiliser ce sucre.

Mots-clés: Helicobacter , gastrite , cancer gastrique , ulcère ,lymphome ,signalisation , acidité , peptidoglycane , muqueuse , inflammation , génomique , protéomique , régulation uréase , nickel ,adhésion , Escherichia coli



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  ONDET Maxence (mondet@pasteur.fr) (1/2 poste après-midi) DE REUSE Hilde, IP, Chargée de recherche (hdereuse@pasteur.fr)

FERRERO Richard, IP, Chargé de recherche (rferrero@pasteur.fr)

LABIGNE Agnès, IP, Chef de Laboratoire (alabigne@pasteur.fr)

LE BOUGUENEC Chantal, IP, Chargée de recherche (clb@pasteur.fr)

TOUATI Eliette, IP, Chargée de Recherche (etouati@pasteur.fr)

BERNIER-FEBREAU Christine, Doctorante

BONECA Ivo, Postdoctorant

BOUCHET Soizic, Etudiante DEA

BURY-MONE Stéphanie, Doctorante

CHAOUCHE Nadia, Postdoctorante

CHAPUT Catherine, Doctorante

CONTRERAS DE CAMACHO Monica, Doctorante

DELATTRE Maryline, Etudiante en Maîtrise

GISMERO ORDONEZ Juana (Université de Sao Paulo, Brésil)

GOBERT Alain, Postdoctorant (Boursier Roux)

KAOUKAB Abdelmoughit, Etudiant en Licence

PINTO Alicia Viviana (Université de Buenos Aires, Argentine)

SKOULOUBRIS Stéphane, postdoctorant à l'Université Johns Hopkins, Baltimore, MD, USA

CHEVALIER Catherine, Ingénieur d'Etudes INSERM (mutation à Nantes au 1er septembre)

du MERLE Laurence, Technicienne Supérieure de Laboratoire (dlaur@pasteur.fr)

ECOBICHON Chantal, Technicienne Supérieure de Laboratoire (ceco@pasteur.fr)

MICHEL Valérie, Technicienne Supérieure de Laboratoire (vmichel@pasteur.fr)

ONDET Maxence, Secrétaire (mondet@pasteur.fr)

THIBERGE Jean-Michel, Technicien Supérieur de Laboratoire (jmthiber@pasteur.fr)


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