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Version PDF      Biologie des Interactions Cellulaires - URA CNRS


  Responsable : Dautry-Varsat Alice (adautry@pasteur.fr)


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Les travaux de l'unité portent sur deux thèmes : récepteurs membranaires du système immunitaire et Chlamydia, bactéries intracellulaires responsables principalement de pneumopathies, de maladies sexuellement transmises et de cécités. Nous étudions les mécanismes d'entrée et le devenir intracellulaire de récepteurs et de bactéries, ainsi que les conséquences physiologiques de ce trafic.



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Les cellules communiquent entre elles et avec leur environnement par l'intermédiaire de récepteurs membranaires qui reconnaissent des composés à l'extérieur de la cellule. Ces interactions peuvent induire un signal intracellulaire et/ou permettre l'entrée de macromolécules voire d'agents pathogènes.

Dans la plupart des cas, l'entrée se fait dans des compartiments intracellulaires délimités par des membranes puis les composants sont triés vers leur destination cellulaire finale.

Les travaux de l'Unité sont consacrés à l'étude de l'entrée, du devenir et du tri intracellulaire vers les compartiments membranaires des cellules eucaryotes de récepteurs membranaires et de bactéries intracellulaires, les Chlamydia. Les récepteurs étudiés sont des récepteurs de lymphocytes, importants pour la réponse immune : le récepteur à l'antigène des lymphocytes T (TCR) et le récepteur d'une cytokine, l'interleukine 2 (IL2). Nous étudions la dynamique de ces récepteurs à la membrane plasmique et dans des compartiments intracellulaires. Les Chlamydia sont, selon les souches, responsables d'infections génitales, oculaires ou respiratoires, et pourraient être impliquées dans l'athérosclérose. Nous étudions leur voie d'entrée et leur développement dans les cellules-hôtes.

1. DYNAMIQUE DES RECEPTEURS ET TRAFIC INTRACELLULAIRE (A. Dautry-Varsat, A. Alcover, V. Das, F. Gesbert, B. Nal, N. Sauvonnet)

Les récepteurs membranaires reconnaissent leur ligand extracellulaire et cette interaction est suivie de l'endocytose du complexe ligand-récepteur. Les récepteurs et ligands sont alors soumis à différentes étapes de tri dans les compartiments membranaires. Par ailleurs, les processus d'endocytose conduisent à des modifications d'expression, de fonction et de localisation des composants membranaires.

Les voies d'endocytose

L'endocytose par récepteur permet aux cellules de communiquer avec leur environnement par l'intermédiaire de récepteurs membranaires qui reconnaissent spécifiquement des molécules du milieu extra-cellulaire. Ce processus est essentiel pour l'homéostasie de la cellule puisqu'il contrôle des fonctions aussi diverses que l'apport spécifique de nutriments, la réponse cellulaire aux hormones et autres facteurs de croissance, la capture des antigènes par les cellules présentatrices et l'entrée de certains pathogènes.

Le mécanisme d'endocytose le mieux connu est celui qui implique d'abord la localisation des récepteurs dans des régions particulières de la membrane plasmique, les puits recouverts de clathrine. Ceux-ci se creusent pour former des vésicules recouvertes qui bourgeonnent à partir de la membrane puis perdent rapidement leur manteau de clathrine. Ces vésicules qui transportent les complexes récepteur-ligand fusionnent ensuite avec des compartiments membranaires intracellulaires, les endosomes.

L'identification de la protéine Eps15 en tant qu'acteur dans le mécanisme d'endocytose nous a permis de développer des outils puissants qui bloquent spécifiquement la voie d'endocytose dépendante de la clathrine.

Nous aidant de ces mutants, nous avons identifié l'interleukine 2 (IL2), un facteur de croissance essentiel pour les lymphocytes, comme le premier ligand physiologique internalisé dans les lymphocytes par une nouvelle voie d'endocytose.

L'endocytose des récepteurs de l'IL2 par cette voie est rapide et efficace. L'analyse morphologique montre que ces récepteurs ne sont pas localisés dans les structures à clathrine, au contraire des récepteurs de la transferrine, marqueurs de la voie d'endocytose dépendante de la clathrine. Les récepteurs de l'IL2 sont en fait associés de façon constitutive à des microdomaines membranaires riches en cholestérol et en glycosphingolipides, aussi appelés "lipid rafts". Après internalisation, les récepteurs sont encore dans des microdomaines lipidiques dans les endosomes. Recherchant la régulation moléculaire de cette nouvelle voie d'endocytose, nous avons montré que les petites GTPases de la famille Rho contrôlent spécifiquement la voie indépendante de la clathrine, tandis que la GTPase dynamine est impliquée dans la régulation des voies dépendantes et indépendantes de la clathrine. Les études en cours ont pour but d'analyser les rôle de l'IL2 dans la localisation de ces récepteurs dans les microdomaines. D'autre part, ils visent à comprendre les liens entre cette nouvelle voie d'endocytose et la cascade de signalisation induite par l'IL2.

Le tri intracellulaire des récepteurs internalisés : rôle de l'ubiquitination

Suite à leur internalisation, les récepteurs de l'IL2, atteignent les endosomes, où ils subissent des étapes de tri intracellulaire pour être soit recyclés à la membrane plasmique, soit acheminés vers les lysosomes où ils sont dégradés. Nos travaux récents ont conduit à l'identification d'une courte séquence dans la partie intracellulaire de la chaîne b du récepteur IL2 (IL2Rb), responsable de l'adressage vers les lysosomes. En parallèle, nous avons observé que la chaîne IL2Rb est mono-ubiquitinée. L'ubiquitine est une petite protéine très conservée dont le rôle a été clairement établi dans la dégradation de protéines par le protéasome et plus récemment dans le contrôle du trafic intracellulaire vers les endosomes tardifs/lysosomes. L'inhibition de l'addition d'ubiquitine sur la chaîne IL2Rb prévient le tri vers les lysosomes, et donc la dégradation de IL-2Rb, sans modifier son endocytose. Des résultats similaires ont été obtenus en modifiant la séquence de tri, décrite ci-dessus, de manière à empêcher l'addition d'ubiquitine. Nos travaux actuels portent sur différents aspects de la régulation de l'expression de la chaîne IL-2Rb par l'addition d'ubiquitine. Nous recherchons les résidus cibles potentiellement " ubiquitinables " ainsi que les protéines responsables du tri intracellulaire qui accompagnent le récepteur IL2 ubiquitiné au cours du trafic de l'endosome précoce jusqu'au lysosome.

Réponse des lymphocytes T aux superantigènes bactériens

Certaines toxines bactériennes responsables d'intoxications alimentaires, induisent une forte activation des lymphocytes T et sont également à l'origine d'autres pathologies. Ces toxines appelées superantigènes, sont capables d'induire une réponse immunitaire forte même lorsqu'elles sont présentes en faible quantité. Cette réponse est due à la reconnaissance de ces toxines par les lymphocytes T. Nous avons montré que ce phénomène met en jeu des interactions entre récepteurs à l'antigène sur la membrane des lymphocytes T, que ceux-ci aient lié un superantigène ou simplement qu'ils soient proches de récepteurs ayant lié un superantigène.

La reconnaissance de ces toxines induit des changements de morphologie et de polarisation cellulaire, dus à une profonde réorganisation des composants de la membrane et du cytosquelette (Figure 1). Nous avons montré que des protéines établissant des liens entre la membrane et le cytosquelette, telles que l'ezrine, sont essentielles pour le regroupement des récepteurs à l'antigène des lymphocytes T au site de contact avec les cellules présentatrices d'antigène, ainsi que pour l'activation des lymphocytes T.

Polarisation du récepteur à l'antigène des lymphocytes T et formation de la "synapse immunologique". Rôle du cytosquelette d'actine.

Une étape fondamentale de la réponse immune est la reconnaissance par les lymphocytes T des antigènes exposés à la surface de cellules présentatrices d'antigène. Après reconnaissance de l'antigène, Il se forme entre les lymphocytes T et les cellules présentatrices d'antigène un contact étroit que l'on appelle "synapse immunologique", par analogie avec la synapse neuronale. La synapse immunologique est caractérisée par une accumulation ordonnée de récepteurs à l'antigène des lymphocytes T (récepteurs T), de protéines d'adhérence, du cytosquelette et de signalisation cellulaire. Il a été proposé que la synapse immunologique facilite la transmission du signal d'activation aux lymphocytes T.

Nous étudions les mécanismes de formation de cette synapse ainsi que ses fonctions, plus particulièrement le rôle du cytosquelette d'actine et du trafic intracellulaire. Nous avons recherché le rôle de l'ezrine, une protéine qui établit des liens entre la membrane plasmique et le cytosquelette d'actine, dans la formation de la synapse immunologique et la réponse des lymphocytes T. Nous avons observé par microscopie confocale que se l'ezrine se concentre à la jonction entre le lymphocyte T et la cellule présentant un antigène (Figure 1). Ceci indique que l'ezrine est impliquée dans la réorganisation du cytosquelette d'actine induite par l'activation antigénique.

Nous avons recherché l'importance fonctionnelle de l'ezrine dans la réponse des lymphocytes T à l'aide de mutants dominants négatifs de l'ezrine. Par microscopie confocale et analyse d'images quantitative, nous avons observé que la sur-expression d'un mutant dominant négatif de l'ezrine inhibe le rassemblement des récepteurs T à la jonction avec la cellule présentatrice d'antigène, ainsi que l'accumulation de la protéine kinase C theta, une molécule importante pour la transmission du signal d'activation des lymphocytes T. De plus, la sur-expression de ce mutant d'ezrine inhibe des étapes ultérieures de l'activation des lymphocytes T. Ces résultats nous ont permis de proposer un nouveau rôle pour l'ezrine dans les lymphocytes T. Grace à sa capacité à relier des composants membranaires au cytosquelette d'actine, l'ezrine faciliterait la localisation à la synapse immune de récepteurs et de molécules de signalisation, renforçant donc le mécanisme d'activation des lymphocytes T.

2. Invasion par Des bactéries INTRACELLULAIRES, LES Chlamydias(A. Dautry-Varsat, A. Subtil, M. E. Balana, C. Delevoye, B. Wyplosz)

Les bactéries Chlamydia se développent exclusivement à l'intérieur d'une cellule-hôte. Trois espèces sont pathogènes pour l'homme et sont responsables essentiellement de pneumopathies, de maladies sexuellement transmissibles et du trachome. Les bactéries se multiplient dans un compartiment membranaire appelé inclusion, d'où elles sont capables de détourner à leur bénéfice les fonctions des cellules épithéliales qu'elles infectent. Les infections primaires sont très souvent relativement mineures, voire asymptomatiques. Les séquelles, cécité, stérilité, grossesse extra-utérine, apparaissent longtemps après l'infection. Tout le cycle intracellulaire des Chlamydias a lieu dans une vacuole délimitée par une membrane dans laquelle elles se différencient et prolifèrent (Figure 2). A la fin de ce cycle, la cellule est lysée et des formes infectieuses des bactéries sont libérées. Nous étudions les mécanismes par lesquels ces bactéries entrent dans les cellules, s'y développent et modifient les cellules-hôtes.

Le développement des Chlamydia dépend de leur aptitude à être internalisées, en particulier par les cellules épithéliales, qui constituent leur cible principale. Grâce aux mutants dominants négatifs de la protéine Eps15 que nous avions obtenus précédemment,  nous avons montré que l'entrée des Chlamydia n'implique pas la voie d'entrée des puits recouverts de clathrine. De plus, la cytochalasine D, dépolymérisant du cytosquelette d'actine, inhibe l'entrée des trois espèces de Chlamydia. Ces données indiquent que l'entrée de Chlamydia s'apparente plutôt à un phénomène de phagocytose, bien qu'elle ait lieu dans des cellules épithéliales.

Nous avons montré l'implication de microdomaines membranaires riches en cholestérol et sphingolipides (ou "rafts ") dans l'entrée de Chlamydia. En effet, les bactéries se concentrent dans ces domaines membranaires, à la surface cellulaire. De plus, si l'on perturbe la formation de ces microdomaines, on empêche l'entrée des bactéries dans les cellules. Enfin, lorsqu'elles sont à l'intérieur des cellules dans les inclusions, les Chlamydia sont encore dans des microdomaines lipidiques. Ce mécanisme d'entrée pourrait expliquer pourquoi il n'a pas été trouvé dans l'inclusion de marqueurs d'endocytose classiques. Il pourrait également expliquer certaines propriétés de l'inclusion, qui semble interagir par trafic vésiculaire avec la voie de sécrétion et non avec celle d'endocytose.

L'inclusion est un compartiment membranaire dont la taille augmente très rapidement au cours de l'infection. Cette membrane contient des lipides qui proviennent de la cellule-hôte. Elle reçoit également des protéines qui proviennent des bactéries qui prolifèrent à l'intérieur de l'inclusion. Nous avons démontré que les Chlamydia utilisent un système de sécrétion commun à différentes bactéries pathogènes pour sécréter des protéines à travers la membrane de l'inclusion. Nous développons actuellement une approche systématique pour rechercher les protéines sécrétées par ce type de mécanisme (dit de type III) dans la cellule-hôte au cours de l'infection. Nous avons identifié plusieurs protéines candidates dont la caractérisation est en cours. Il est très probable que ces protéines jouent un rôle important dans la pathogénicité des Chlamydia.

Figure 1. Lymphocyte T humain (Tc) interagissant avec une cellule qui présente un superantigène bactérien (APC). On observe par microscopie confocale l'ezrine, protéine associée au cytosquelette d'actine (rouge) et le récepteur à l'antigène du lymphocyte T (vert) qui sont polarisés vers la cellule présentatrice d'antigène (immunofluorescence ; figure de droite). A gauche, on observe la morphologie de ces deux cellules par contraste interférentiel.

Figure 2.Schéma du cycle de développement de Chlamydia. L'intégralité du cycle se déroule dans une cellule-hôte, en 48 à 72 heures. La forme infectieuse (EB) se différencie en forme proliférative (RB) qui se multiplie puis se différencie en EB en fin de cycle.

Mots-clés: Endocytose, trafic intracellulaire, récepteur de l'interleukine 2, récepteur à l'antigène des lymphocytes T, ezrine, cytosquelette d'actine, synapse immunologique, Chlamydia, sécrétion bactérienne de type III



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  GOISNARD Christiane, IP, (cgoisnar@pasteur.fr) ALCOVER Andrés, IP, (Chef de Laboratoire, HDR,aalcover@pasteur.fr)

DAUTRY-VARSAT Alice, IP, (Professeur, HDR,adautry@pasteur.fr)

GESBERT, Franck, IP, (Chargé de Recherche,fgesbert@pasteur.fr)

SUBTIL Agathe, CNRS, (Chargée de Recherche,asubtil@pasteur.fr)

BALANA, Maria-Eugenia, Stagiaire post-doctorale,mbalana@pasteur.fr

DAS Vincent, Médecin-doctorant,vdas@pasteur.fr

DELEVOYE Cédric, Doctorant,delevoye@pasteur.fr

NAL Béatrice, Stagiaire post-doctorale,bnal@pasteur.fr

SAUVONNET Nathalie, Stagiaire post-doctorale,nathsauv@pasteur.fr

WYPLOSZ Benjamin, Médecin-doctorant,bwyplosz@pasteur.frvdas@pasteur.fr

DUJEANCOURT, Annick, IP, (Technicienne,adujean@pasteur.fr)

PERRINET, Stéphanie, CNRS, (Technicienne,perrinet@pasteur.fr)

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