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Version PDF      Staphylocoques


  Responsable : Névine El Solh (nelsolh@pasteur.fr)


  resume

 

Les staphylocoques sont des agents étiologiques d'infections bactériennes sévères dont la prévalence est particulièrement élevée en pathologie infectieuse. Les difficultés thérapeutiques résultent de la multirésistance aux antibiotiques des souches hospitalières. Deux thématiques ont été abordées : (i) l'étude de la résistance aux antibiotiques qui contribue à l'optimisation de leur usage en thérapie et à la conception de nouvelles molécules et (ii) l'étude des propriétés de liaison aux protéines staphylococciques qui vise à une meilleure compréhension de la physio-pathologie des infections sur prothèse.



  rapport

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Plusieurs types d'interaction avec la fibronectine ont été décelés dans le domaine central de l'autolysine, AtlC, de Staphylococcus caprae - J. Allignet, I. Old et N. EL Solh, en collaboration avec P. England.

Les autolysines staphylococciques de type Atl sont constituées par deux domaines enzymatiques séparés par une région centrale constituée par trois séquences peptidiques imparfaitement répétées (R1-R2-R3) incluant chacune deux motifs GW (glycine-tryptophane). Les régions centrales des autolysines Atl (S. aureus), AtlE (S. epidermidis) et AtlC (S. caprae) fusionnées à l'hexapeptide Histidine se lient à plusieurs protéines matricielles : fibronectine, fibrinogène, vitronectine et sialoprotéine osseuse. Le biosenseur optique BIAcore a été utilisé pour l'analyse de la cinétique d'interaction avec la fibronectine immobilisée. Les constantes cinétiques d'interaction avec la souche de S. caprae sont similaires à celles publiées d'une souche de S. epidermidis. L'affinité pour la fibronectine du domaine de AtlC contenant les régions répétées R1-R2-R3 est significative (kd= 2.48 nM) et similaire à celle des protéines produites par les souches de S. aureus et de streptocoques (kd= 3.16 nM). L'aspect des courbes de cinétique d'interaction suggère l'existence de deux types d'interactions d'affinités variables et de multiples sites d'interaction (» 10) pouvant se situer dans chacun des deux ligands. Les courbes de cinétique d'interaction avec la fibronectine des régions comprenant R3 ou R1-R2 fusionnées séparément à l'hexapeptide Histidine ont été également analysées. La constante de dissociation de His6-AtlCR3 avec la fibronectine (0,5 nM) était plus faible que celle de His6-AtlCR1-R2-R3 ou His6-AtlCR1-R2 (2.5 nM). Les deux types d'interaction décelés pour R1-R2-R3 ont été observés pour R1-R2 mais pas pour R3. La purification des domaines R1 et R2 fusionnés séparément à His6 qui est en cours est un pré-requis pour expliciter les discordances observées.

La délimitation de la (ou des) région(s) de fibronectine interagissant avec les régions répétées R1-R2-R3 de AtlC a été également abordée par la méthode basée sur la sélection de phages exprimant une banque d'heptapeptides et ayant une forte affinité pour les régions répétées (Phage Display). Les résultats du criblage des 46 phages de ce type ont permis la sélection de plusieurs peptides de fibronectine destinés à évaluer leur aptitude à inhiber la fixation de AtlC à la fibronectine, par ELISA. Le peptide WQPPRARI est le seul qui s'est avéré capable d'inhiber totalement la liaison. Cette séquence, retrouvée dans la région C-terminale de la fibronectine, est responsable de la liaison à l'héparine.

Emergence dans les hôpitaux français et depuis 1998, de souches de S. aureus ayant un génotype inhabituel de résistance aux streptogramines - J. Haroche, A. Morvan, M. Davi, Jeanine Allignet, N. El Solh.

Ces souches présentent la particularité de véhiculer les gènes vat(A) et vgb(A) codant, repectivement, une acetyltransferase inactivant la streptogramine A et une lyase inactivant la streptogramine B. Dans des études antérieures, nous avions montré que ces deux gènes étaient régulièrement associés avec vga(A) codant une protéine ABC qui confère la résistance à la streptogramine A. Les trois gènes étaient détectés dans un fragment de 12,1 kb commun à des plasmides de tailles variables (26 à 45 kb) et résultant de la cointégration de deux plasmides : un plasmide similaire à pAMB1 contenant vat(A)-vgb(A) contigus et dont le gène de réplication est interrompu par la séquence d'insertion IS257 et un plasmide similaire à pSX267 et pSK41 contenant vga(A) et un gène de réplication fonctionnel.

L'analyse du génotype de résistance aux streptogramines de 62 souches de S. aureus isolées dans 14 hôpitaux français de 1976 à 2000 a permis la détection de 25 souches contenant vat(A) et vgb(A). Ces dernières réparties en 19 génotypes SmaI avaient été isolées dans huit hôpitaux et pour 22 d'entre elles, la date d'isolement se situait entre 1998 et 2000. Ces deux gènes contigus et véhiculés par des plasmides de la même taille ( » 30 kb) ont été localisés dans des fragments de restriction HindIII de 9,5 ou de 8 kb (respectivement, 21 et 4 souches). Les fragments HindIII de 9,5 kb contenaient le gène de réplication pAMb 1 dont la position relative par rapport à vat(A)-vga(A) (1,45 kb) était similaire à celle observée dans les plasmides vat(A)-vgb(A)-vgb(A), ce qui suggère une conservation structurale dans cette région des plasmides. En conclusion, les souches de S. aureus vat(A)-vgb(A) ont émergé avec une fréquence accrue depuis 1998 et dans la majorité des cas, elles résultent d'un remaniement survenu dans un plasmide qui s'est disséminé dans des clones distincts.

Analyse structurale et fonctionnelle de la protéine Vga(A) - O. Chesneau, N. El Solh, en collaboration avec Jean-Michel Betton, Sylvie Dartevelle, Elie Dassa, Jean-Luc Guesdon, Muriel Delepierre.

Le PTR n°55 se propose de caractériser le mécanisme de fonctionnement d'une protéine ABC bi-domaine impliquée dans la résistance aux streptogramines. La localisation sub-cellulaire, les études génétiques et les premiers essais d'analyse biochimique de Vga(A) suggèrent que cette protéine interagit avec la membrane des staphylocoques via un ou plusieurs partenaires qu'il convient d'identifier. Sa participation à un efflux de l'antibiotique chez le staphylocoque reste à démontrer. Des anticorps monoclonaux sont actuellement testés pour cibler les épitopes spécifiques de Vga(A) qui permettraient de la distinguer des autres protéines de même type décelées suite aux programmes de séquençage systématique des génomes microbiens (cf. la base de données ABSCISSE à l'adresse http://www.pasteur.fr/recherche/unites/pmtg/abc/database.html).

Activités du Centre National de Référence (CNR) des staphylocoques

L'activité d'expertise du CNR a porté principalement sur la taxonomie, le typage et la résistance aux antibiotiques. En 2002, 545 souches ont été analysées. Le facteur préocuppant s'est révélé être la dissémination, dans plusieurs hôpitaux français, de clones épidémiques de S. aureus résistant aux b -lactamines et de sensibilité diminuée aux glycopeptides.

Mots-clés: Staphylocoques, adhésines, streptogramines, glycopeptides



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Gallais, Beatrice,bgallais@pasteur.fr El Solh, Névine, Chef d’unité,nelsolh@pasteur.fr

Chesneau, Olivier, Chargé de recherche,chesneau@pasteur.fr

Old, Iain, Assistant,igold@pasteur.fr

Haroche, Julien, Thèse,jharoche@pasteur.fr

Trad, Salim, DEA,strad@pasteur.fr

Allignet, Jeanine, Ingénieur position II,allignet@pasteur.fr

Davi, Marilyne, Technicienne supérieure de laboratoire 2D,mdavi@pasteur.fr

Morvan, Anne, Technicienne supérieure de laboratoire 2D,amorvan@pasteur.fr


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