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Version PDF      Régulation de la traduction eucaryote et virale - CNRS URA 1966


  Responsable : KEAN, Katherine M. (kathiemb@pasteur.fr)


  resume

 

Notre but primaire cette année était de consolider nos résultats préliminaires et hypothèses concernant l'initiation de la synthèse protéique (traduction) virale. Plusieurs virus à ARN ont été étudiés (picornavirus, virus de l'hépatite C, virus rabique, rotavirus). En traduction cellulaire, nous avons abordé l'étude de l'FGF6, un membre de la famille des facteurs de croissance fibroblastiques - cytokines impliquées dans des processus physiologiques tels que l'oncogenèse, l'angiogenèse, la morphogenèse, la régenération et la survie tissulaire.



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Analyse structure-fonction de l'IRES du poliovirus (PV)

Les ARNm des picornavirus font partie de ceux qui sont traduits par un mécanisme alternatif, par initiation à partir d'un IRES (pour Internal Ribosome Entry Segment). Les IRES des picornavirus sont longues d'environ 450 nt, structurés en différents domaines. Le domaine E est d'une grande importance pour la neurovirulence du PV, contenant des résidus qui sont mutés dans les trois souches vaccinales qui ont joué un rôle clé dans le contrôle de la poliomyélite paralytique depuis les années 1950 et dans l'objectif imminent d'éradication mondiale de cette maladie. Pour mieux comprendre comment ces déterminants potentiels d'atténuation agissent, nous les avons placé dans un même contexte génomique, celui du PV de type 1 sauvage. L'année dernière nous avons trouvé qu'un seul d'entre eux résulte en un IRES fortement défectueux. Auparavant, il a été proposé que la présence de cette mutation déstabiliserait la structure d'une tige au sein du domaine E de l'IRES. Cette année nous avons examiné cette hypothèse par des techniques biophysiques de courbes de fusion de l'ARN (en collaboration avec E Westhof et A Werner, IBMC, Strasbourg). Nos résultats tendent à démontrer au contraire une renforcement de cette tige à basse force ionique. Ceci contredit le dogme actuel de la corrélation entre la structure de l'IRES et sa fonction. Ainsi, nous sommes en train d'effectuer des études de sondage biochimique et enzymatique de l'ARN dans ces mêmes conditions pour confirmer ces résultats.

Communication entre l'IRES et la queue poly(A) en 3' des ARNm des picornavirus

Les IRES des picornavirus ont été classifié en 3 groupes selon leurs séquences primaires et structures secondaires prédites, ainsi que leurs propriétés fonctionnelles. Nous avons déjà montré que la présence de la queue poly(A) en 3' de l'ARNm stimule l'efficacité de l' initiation de la traduction à partir des IRES représentatives de tous les trois types. Cette stimulation est mediée par des interactions entre les protéines qui fixent l'IRES en 5' et la queue poly(A), qui sont analogues à celles qui permettent de circulariser physiquement les ARNm cellulaires et sont nécessaires pour leur traduction efficace. Cependant, nous avons trouvé l'année dernière que pour les ARNm cellulaires coiffés, l'apport des chaînes poly(A) exogènes peut se substituer à la co-opération entre le coiffe en 5' et la queue poly(A) en 3'. Cette année nous avons étudié les effets des chaînes poly(A) exogènes sur l'activité des IRES des picornavirus. Nous avons constaté non seulement une stimulation mais aussi une inhibition de l'efficacité de la traduction selon l'IRES analysé et de façon très intéressant les membres de l'un des groupes d'IRES se divisent dans les deux camps opposés. La répartition observée corrèle avec des propriétés biologiques des différents virus que l'on pensait intervenir dans le cycle viral après la stimulation de la traduction par la queue poly(A).

Communication entre les extremités 5' et 3' des ARNm du rotavirus et du virus de l'hépatite C (HCV)

Les ARNm du rotavirus sont coiffés à l'extrémité 5', mais ne sont pas polyadenylés à leurs extrémités 3', qui comportent une séquence consensus de 7 nt qui fixe une protéine virale NSP3. NSP3 pourrait jouer un rôle équivalent à celui de la protéine cellulaire PABP, qui fixe la queue poly(A), en termes de la circularisation de l'ARNm viral. Cette année nous avons montré que l'analogie fonctionnelle entre ces protéines s'étend à une stimulation dramatique de l'efficacité de la traduction de l'ARNm rotaviral par la protéine NSP3. Ainsi, encore une fois des interactions ARN-protéine et protéine-protéine qui circulariseraient l'ARNm sont impliquées dans l'initiation efficace de la traduction. Comme pour les effets de la poly(A) sur la traduction coiffe-dependent, la séquence rotavirale est un stimulateur aussi efficace lors qu'elle est fournie en trans qu'en cis. L'ARNm virale la plus particulière que nous avons étudié est celle du HCV, qui comporte un IRES en 5' et 98 nt fortement structurés en forme d'une feuille à trèfle (la région X) à l'extrémité 3' plutôt qu'une queue poly(A). Cependant, nous avons déjà démontré que la traduction à partir de l'IRES du HCV est stimulée par la présence de la région X à l'extrémité 3' de l'ARN et nous avons proposé que l'ARN du HCV serait circularisé, mais par un complexe protéique totalement différent de celui en jeu pour les autres ARNm analysés. Cette hypothèse est actuellement à l'étude par des techniques de microscopie électronique (en collaboration avec G. Pehau-Arnaudet, Plate-forme de cryomicroscopie moléculaire, Institut Pasteur — voir son rapport d'activité). Entre temps, nous avons montré que malgré les différences significatives entre l'ARNm du HCV et les autres ARNm étudiés, la région X fourni en trans peut stimuler la traduction à partit de l'IRES.

Les différents cas observés de stimulation de l'initiation de la traduction par des séquences 3' en trans nient à l'hypothèse d'un recyclage en continue des ribosomes qui viennent de terminer un cycle de traduction, indiquant plutôt soit une augmentation du recrutement de novo des ribosomes soit un transfert direct du sous unité ribosomique 40S du codon stop à l'extrémité 5' de l'ARN. De plus, elle ouvre la possibilité que les ARNm compétents pour la traduction pourraient agir de façon altruiste, en prêtant leurs extrémités 3' à des voisins qui n'en ont plus.

Caractérisation de la distribution quasi-espèce de l'IRES du HCV chez l'homme

Cette année, nous avons étendu une étude fonctionnelle concernant des patients infectés par le HCV de génotype 1b or 3a démarrée l'année dernière en collaboration avec J-M. Pawlotsky et M. Soler (hôpital Henri Mondor, Créteil), examinant l'activité intrinsèque des IRES variants et leurs stimulation par la région X. La région X de l'ARN du HCV est un modulateur remarquable de l'activité des IRES variants. Sa capacité de stimulation peut monter de 3 à 1000 fois, selon la séquence exacte de l'IRES et son activité intrinsèque, mais X peut également être neutre ou inhibiteur. Ces effets différentiels de la région X ne sont pas spécifiques des IRES provenant d'un seul génotype. Des différences fonctionnelles entre des IRES variants corrèlent avec des différences structurales décelées par sondage biochimique et enzymatique de l'ARN.

Régulation de la traduction du virus rabique (RV) (en collaboration avec Y. Jacob et E. Real, Département de Virologie, Institut Pasteur)

RV, un Rhabdovirus, induit une inhibition partielle de la synthèse macromoléculaire dans la cellule hôte. Pour le VSV, qui est le prototype des Rhabdoviridae, la protéine virale Matrice (M2) a été impliquée dans cette inhibition. Par le biais du système " double-hybride " chez la levure, nous avons identifié la sous-unité p40 de la complexe eIF3 (complexe responsable de la livraison de la sous-unité ribosomique 40S à l'extrémité 5' de l'ARNm par son interaction à la fois avec la sous unité 40S et la protéine eIF4G) comme facteur qui interagisse avec la protéine M2 du RV. L'interaction M2-p40 a été confirmée par co-immunoprecipitation des deux protéines après leur synthèse in vitro. De plus, nous avons démontré que la traduction d'un ARN artificiel codant pour M2 est 10 fois moins efficace qu'un ARN témoin in vitro. La mutation d'un motif PPxY, qui est fortement conservé dans la protéine M2 des Rhabdovirus, réduit l'affinité de l'interaction M2-p40, et sauve partiellement l'efficacité de la traduction in vitro. L'ensemble de nos résultats nous a conduit à proposer un modèle original de régulation de la traduction, selon lequel la protéine M2 néo-synthétisée interagira immédiatement avec la complexe eIF3 qui est fixée sur l'ARN virale, et bloquera les cycles supplémentaires d'initiation de la traduction. Cette hypothèse est soutenue par des résultats récents, où nous avons synthétisé la protéine M2 à partir de l'IRES d'un virus d'insecte qui agit de façon indépendante de la complexe eIF3. Dans ce cas, la traduction de l'ARN codant pour la protéine M2 est aussi efficace qui celle d'un ARN codant pour une protéine témoin.

Régulation de la traduction de la protéine FGF6 de la souris

Nous avons choisi d'examiner la régulation de la traduction de cette protéine à cause de ses propriétés physiologiques, mais également à cause de la nature de l'ARNm. En effet, l'ARNm comprend trois sites potentiels d'initiation de la traduction. De plus, l'expression génétique de l'FGF6 est très étroitement contrôlée aussi bien dans l'espace que dans le temps, étant restreinte aux précurseurs de muscle squelettique pendant 7 jours du développement embryonnaire. Nous avons trouvé deux ARNm codant la protéine FGF6 qui diffèrent dans la longueur de leurs régions 5' noncodantes. De plus, nous avons montré que le profil protéique endogène dans différentes lignées cellulaires de souris varie dramatiquement, c.a.d. il semble que le profil d'usage de codon d'initiation varie selon le type cellulaire et son état de différentiation. Pour l'instant, nous n'avons pas pu déterminer si l'utilisation différentielle des deux ARNm joue un rôle dans la régulation de la traduction de l'FGF6.

Mots-clés: Initiation de la traduction, IRES, ARN structure-fonction, coopération ARNm 5’-3’, eIF3



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  BALLET, Saskya (sballet@pasteur.fr) KEAN, Katherine M., CNRS, (DR2, chef d’Unité,kathiemb@pasteur.fr)

BORMAN, Andrew M., IP, (CR)

MICHEL, Yanne M., étudiante en thèse

MALNOU, Cécile E., étudiante en thèse

QUESNOIT, Mélanie, étudiante en DEA

DEVAUX, Vanessa, étudiante en licence

JUFFROY, Olivier, étudiant en licence

LHUILLIER, Pierre, étudiant en licence

PAULOUS, Sylvie, IP, (technicienne)

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