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Version PDF      Régulations Transcriptionnelles - CNRS URA 2172


  Responsable : Kolb, Annie (akolb@pasteur.fr)


  resume

 

Le démarrage de la transcription est la première étape de l'expression génique et la cible de nombreuses régulations. Notre travail porte sur deux thèmes principaux : la transition de la phase exponentielle à la phase stationnaire et les étapes précoces de l'infection par le bactériophage T4. Les facteurs sigma et anti-sigma de l'ARN polymérase jouent un rôle crucial dans la réponse à ces stress.



  rapport

cale

L'holoenzyme bactérienne est composée de l'enzyme cœur E constitué de 5 sous-unités (a2 b b' w) qui porte la machinerie catalytique, et d'un facteur s , responsable de la liaison au promoteur. La nature du facteur s détermine la spécificité de reconnaissance de l'ARN polymérase vis-à-vis du promoteur et chaque holoenzyme reconnaît une classe différente de promoteurs. Chez E. coli, il existe 7 facteurs s qui entrent en compétition pour la fixation à l'enzyme coeur. De nombreux facteurs s sont induits en réponse aux variations de l'environnement et sont très souvent contrôlés par des facteurs anti-s

ComparAison Entre les ARN POLYMERASES DE PHASE EXPONENTIELLE ET DE PHASE STATIONNAIRE Es 70 ET EsS (C. Deshayes, A. Kolb, G. Jan, S. Lacour, E. Marquenet, E.Tate)

Les bactéries passent la majorité de leur temps sans se multiplier : en phase stationnaire, elles présentent une résistance accrue à de nombreux stress (variations de température, de pH, d'osmolarité, résistance à l'eau oxygénée et aux antibiotiques...)

A l'entrée en phase stationnaire, il se produit des changements profonds de l'expression génétique qui sont encore mal compris. Chez les entérobactéries, à côté de s70 le facteur s majeur, apparaît un nouveau facteur d'initiation s S capable de diriger l'ARN polymérase vers une nouvelle classe de promoteurs. Produit du gène rpoS, s S est également induit en phase exponentielle de croissance à la suite de différents stress physiques ou chimiques et apparaît comme un régulateur central pour la survie des bactéries dans leur environnement naturel, la résistance généralisée aux stress et le contrôle de la virulence.

De tous les facteurs s, s S est celui qui présente la plus grande homologie avec le facteur s majeur, s 70. La conservation des séquences est particulièrement marquée au niveau des régions impliquées dans la fixation au promoteur. Pourtant Es S et Es 70 reconnaissent des classes distinctes de promoteurs. Les bases de cette discrimination sont encore mal comprises. Les promoteurs qui dépendent de s S sont en général des promoteurs faibles ; la plupart sont dépourvus d'hexamère -35 consensus mais possèdent souvent un C en position -13 en amont de la boîte -10. Le surenroulement de l'ADN et la présence de nombreux facteurs de transcription modulent le démarrage de la transcription des promoteurs dépendants de s S et peuvent même déterminer le choix du facteur s.

In vitro un grand nombre de promoteurs sont reconnus par les deux formes d'ARN polymérases, mais avec des affinités et des cinétiques différentes. La spécificité de reconnaissance apparaît plus stricte et conforme aux résultats in vivo dans un essai de compétition entre les deux facteurs s et l'enzyme coeur, qui est limitant dans la bactérie. s S est moins abondant que s 70 et possède une affinité 5 fois moindre pour l'enzyme coeur. D'autres facteurs semblent donc nécessaires in vivo pour permettre à s S de rivaliser avec s 70 .

LES INTERACTIONS s / ANTI-s(S. Igonet , G. Orsini)

Les facteurs anti-s sont des protéines régulatrices qui se lient spécifiquement à un facteur s et régulent in vivo la disponibilité et l'activité de ce facteur. Avec AsiA, le facteur anti-s 70 du phage T4, nous nous intéressons au mécanisme d'action de ce facteur ainsi qu'au rôle des contacts amont ARN polymérase-ADN du promoteur dans le fonctionnement de cette protéine de 10 kDa.

En se liant à leur cible, la plupart des facteurs anti-s empêchent l'association du facteur s correspondant avec l'enzyme coeur. Le mode d'action d'AsiA est plus complexe car cette protéine exerce sur la transcription par l'holoenzyme Es 70 deux effets que l'on peut distinguer :

-1. AsiA se lie fortement à la région 4 du facteur s 70 et inhibe la transcription à partir de promoteurs bactériens possédant des motifs consensus " -10-35 " et dépendant de s 70.

-2. La transcription à partir des promoteurs moyens du phage T4 requiert le complexe s 70-AsiA dans l'holoenzyme ainsi que la présence de la protéine MotA du phage, liée au niveau de l'ADN au motif " —30 "  de ces promoteurs. Au cours du développement du phage, le couple AsiA-MotA permet à l'ARN polymérase de changer de spécificité de reconnaissance et de se réorienter vers d'autres promoteurs .

La liaison d'AsiA à la région 4 de s 70 bloque l'interaction fonctionnelle entre s 70 et le motif -35 en amont des promoteurs classiques d'E. coli, comme le promoteur lacUV5. Par cinétique d'empreinte au permanganate, par attaque à la DNaseI et par photo-pontage au laser UV, nous avons montré que l'ARN polymérase contenant AsiA forme lentement un complexe ouvert et actif au promoteur lacUV5. L'effet majeur d'AsiA est ici de ralentir de près de 2 ordres de grandeur l'ouverture de la bulle de transcription. Ce complexe ternaire holoenzyme-AsiA-lacUV5 est activé par la protéine CRP liée à l'AMP cyclique, ce qui indique l'importance des contacts amont ARN polymérase-promoteur pour la formation de ce complexe ternaire. Ainsi, l'ARN polymérase possédant une délétion du domaine C-terminal des sous-unités a est totalement inhibée par AsiA dans les conditions où l'enzyme sans délétion ne l'est pas.

Nous étudions les propriétés de l'holoenzyme contenant AsiA vis-à-vis de plusieurs promoteurs précoces du phage T4 qui sont des promoteurs très forts. La plupart possèdent en amont une séquence riche en A/T susceptible de lier la sous-unité a de l'ARN polymérase et leur transcription est fortement insensible à l'inhibition exercée par AsiA. Nous analysons les facteurs de l'interaction holoenzyme Es 70 - AsiA -promoteurs précoces qui rendent compte de cette résistance à l'inhibition de la transcription, une propriété sans doute importante pour le développement du phage T4.

Regulation par le complexE CRP-AMP : Collaborations avec E. Krin(1), Institut Pasteur, & Y. Huo et Y-P Wang(2) de l'Université de Pékin

La protéine réceptrice de l'AMP cyclique (CRP) est impliquée dans le catabolisme de nombreuses sources de carbone et contrôle différentes fonctions chez les entérobactéries; son rôle activateur des gènes sensibles à la répression catabolique est bien connu et fait intervenir, pour la plupart des promoteurs, des interactions directes entre l'ARN polymérase contenant le facteur sigma majeur, Es70 et la protéine CRP liée à l'AMP cyclique (CRP-AMPc).

1. Le gène argG, qui spécifie la synthèse de l'argininosuccinate, un des 12 gènes nécessaires à la biosynthèse de l'arginine est régulé positivement par CRP-AMP cyclique mais la distance éloignée du site CRP à l'origine de transcription (-167.5) et l'étude de mutants de contrôle positif suggèrent que l'activation n'a pas lieu via des contacts protéine—protéine avec l'ARN polymérase.

2 . L'inhibition des promoteurs s 54-dépendants constitue un autre cas de régulation atypique par CRP. Dans le cas du promoteur glnAP2, la répression a lieu au niveau du démarrage de la transcription et est indépendante du site liant le complexe CRP-AMPc situé en amont du promoteur.

Mots-clés: ARN polymérase, phase stationnaire, sigma, anti-sigma, AsiA, protéine réceptrice de l’AMP cyclique (CRP), microbiologie moléculaire, biochimie



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Lavenir, Armelle, I.P.,alavenir@pasteur.fr Orsini, Gilbert, Université de Paris VII, (Maître de Conférences,orsini@pasteur.fr) Tate, Edward, postdoc

Igonet, Sébastien, étudiant Paris VI

Marquenet, Emélie, étudiant Paris VII

Jan, Gaëlle, étudiante, Institut National Agronomique de Paris-Grignon

Huo, Yixin, étudiant en thèse, Université de Pékin et de Paris VII,

Lacour Stephan, étudiant en thèse (coopération avec EAWAG, Zurich, Suisse)

Deshayes, Caroline, étudiante Paris VII

Legat, Geneviève, Aide de Laboratoire, I.P.

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