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Version PDF      Régulation Enzymatique des Activités Cellulaires


  Responsable : Michel VERON (mveron@pasteur.fr)


  resume

 

Les thématiques du laboratoire sont :

Etude de la phosphorylation des analogues de nucléotides utilisés dans les thérapies anti-virales.

Etude des propriétés biochimiques de la protéine NEMO, élément régulateur essentiel de la voie de transduction NF-kB impliqué dans deux maladies génétiques humaines.

Etude de la recombinaison chez les rétrovirus in vitro.



  rapport

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Phoshorylation in vitro par la NDP kinase des analogues de nucléotides utilisés dans les thérapies anti-virales. Sarah gallois-montbrun et Dominique deville-bonne

Malgré la découverte de nouveaux inhibiteurs de la croissance virale, les analogues de nucléotides substitués sur la position 3' du ribose comme l'AZT restent indispensables dans tous les protocoles thérapeutiques contre le SIDA. Ils sont toujours donnés aux malades sous forme de nucléosides, molécules non chargées qui peuvent traverser la membrane plasmique. Les analogues sont phosphorylés en dérivés triphosphate par plusieurs kinases cellulaires pour pouvoir agir comme terminateurs de chaines au niveau de la transcriptase inverse. La Nucléoside Diphosphate Kinase (NDP) kinase est considérée comme responsable de la dernière étape de cette voie d'activation.

Nous étudions la réactivité de la NDP kinase humaine recombinante avec plusieurs analogues actuellement utilisés en thérapie anti-VIH (ddI, ddC, AZT, d4T) au niveau biochimique et structural (collaboration J. Janin, LEBS à Gif-sur-Yvette). Par des études à l'état préstationnaire, nous avons montré que la phosphorylation des dérivés diphosphate des analogues est beaucoup moins efficace que pour les nucléotides naturels, ce qui fait de la réaction catalysée par la NDP kinase une étape limitante dans leur activation. Nous avons déterminé les constantes cinétiques et les constantes de fixation de ces différents analogues. La combinaison des études biochimiques et structurales des complexes a permis de proposer un modèle mécanistique précis de la phosphorylation de ces agents thérapeutiques par la NDP kinase.

Le 3TC est un dérivé de configuration -L de la thiacytidine utilisé depuis récemment en thérapie contre le SIDA et l'hépatite B. Des ß-L-désoxynucléosides (ß-L-thymidine et la ß—L-2'-désoxycytidine) ont été reconnus récemment comme des agents potentiels anti-hépatite B. La réactivité des nucléotides et désoxynucléotides de configuration L- avec la NDP kinase humaine est très réduite, en particulier pour le 3TC. Par contre une autre kinase, la phosphoglycérate kinase, reconnaît très bien les nucléotides de configuration L- et assure la formation des L-dXTP au sein de la cellule (collaboration A. Faraj et J.P. Sommadossi, Laboratoire Novirio-CNRS et Université Montpellier II).

La ribavirine, analogue de guanosine, est le seul analogue de nucléoside utilisé contre les virus à ARN et elle pourrait constituer un médicament contre le virus de la dengue, responsable de fièvres hémorragiques. Elle est active au niveau cellulaire sous forme triphosphate. Nous avons évalué l'efficacité d'une série de dérivés de la ribavirine modifiés sur le sucre afin de rechercher un analogue qui soit actif à faible dose et qui génère moins de cytotoxicité. Le dérivé dépourvu d'un hydroxyle en 2' présente des propriétés de phosphorylation par la NDP kinase et d'inhibition de la transcriptase de l'hépatite C proches de celles de la ribavirine et semble une alternative intéressante à la ribavirine (collaboration L. Mulard, Unité de Chimie Organique, Institut Pasteur et B. Canard, ESIL,CNRS, Marseille).

Dans une approche d'ingénierie des protéines, nous cherchons à modifier la NDP kinase humaine au niveau de son site actif pour qu'elle devienne un meilleur agent de conversion des pro-drogues nucléosidiques en nucléotides au sein des cellules infectées. Plusieurs protéines mutantes ont été obtenues qui phosphorylent le d4T et l'AZT avec des constantes cinétiques fortement augmentées en comparaison des protéines de type sauvage. L'effet le plus marqué est obtenu en combinant deux mutations correspondant à deux résidus du site actif. L'enzyme mutant L55H-N115S purifié montre un changement de spécificité de plus de 300 fois. Les travaux en cours ont pour but de déterminer si la présence de cette protéine mutante dans des cellules altère leur capacité de phosphoryler les analogues de nucléotides et leur sensibilité à ces drogues dans la perspective d'applications, notamment dans le cadre des techniques de thérapie cellulaire.

Nous étudions aussi les kinases responsables de l'addition du second phosphate. C'est une famille de kinases qui assure cette étape, chaque kinase étant spécifique de la base. L'UMP-CMP kinase humaine a été clonée et ses propriétés de phosphorylation du L-3TCMP sont excellentes, très proches des nucléotides naturels. Prochainement, nous analyserons la réactivité des dérivés phosphonates qui sont très prometteurs dans les traitements antiviraux.

Propriétés biochimiques de la protéine NEMO, élément régulateur essentiel de la voie de transduction NF-kB. Stéphane Goffinont, Emilie Vinolo et Fabrice Agou

En réponse à une grande variété de stimuli comme les cytokines pro-inflammatoires (TNFa IL-1) ou les endotoxines (LPS), les cellules activent toute une série de gènes impliqués dans les réponses inflammatoire et immunitaire, l'oncogénèse et l'apoptose. La plupart de ces gènes sont sous le contrôle d'un facteur de transcription NF-kB dont l'activation est modulée par un complexe de haut poids moléculaire. Ce complexe multiprotéique appelé IKK est constitué d'au moins trois composantes polypeptidiques distinctes. Deux de ces composantes, IKK-alpha et beta, présentent une activité catalytique de type protéine kinase, alors que la troisième, appelée NEMO (NF-kB Essential MOdulator) ou IKK gamma, est une protéine de régulation qui participe à leur activation. La présence de NEMO est essentielle puisque des cellules de fibroblaste ou de lymphocyte invalidées pour le gène NEMO sont insensibles pour les cytokines et endotoxines induisant la voie de signalisation NF-kB. Au laboratoire nous tentons, en collaboration étroite avec G. Courtois et A. Israël (Unité de Biologie Moléculaire de l'Expression Génique, Institut Pasteur), d'élucider le mécanisme moléculaire par lequel la protéine NEMO favorise la conversion des kinases sous une forme active. Une meilleure compréhension de ce mécanisme permettrait d'élaborer de nouvelles drogues agissant comme anti-inflammatoires et aussi comme anti-cancéreux.

Nous avons réussi à obtenir la protéine NEMO recombinante a l'état homogène après purification en présence de détergents non-ioniques. Nous avons étudié sa structure quaternaire par centrifugation analytique et filtration sur gel, et estimé son taux de structures secondaires par dichroïsme circulaire. Le clonage et la purification d'un fragment correspondant à une partie du domaine C-terminal a permis de mettre en évidence des propriétés d'homo-association de la protéine en dimère et trimère. Cette oligomérisation est gouvernée par une séquence formant des structures en faisceaux torsadés d'hélices alpha de type " coiled-coil ". L'existence de formes dimériques et trimériques a également été démontrée in vivo grâce à la mise au point d'expériences de pontages effectuées sur des cellules en culture en présence d'un réactif bivalent. Par ailleurs, l'association de la protéine recombinante avec la protéine chaperon de E. coli DnaK (Hsp 70) suggère un rôle pour ce type de protéine dans loligomérisation de NEMO in vivo. Les expériences en cours ont pour but d'établir un lien entre l'activation des kinases et le changement de l'état d'oligomérisation de la protéine NEMO.

L'étude biochimique de cette protéine a redoublé d'intérêt lorsque des travaux récents émanant du groupe d'Alain Israël, en étroite collaboration avec des équipes de l'hôpital Necker, ont établi que deux pathologies humaines, Incontinentia pigmenti et la dysplasie ectodermique avec immunodéficience sont dues à des mutations dans la séquence codante pour la protéine NEMO. Un autre aspect de nos travaux consiste donc à établir une corrélation entre les mutations identifiées dans le gène de NEMO chez des patients et l'altération des propriétés biochimiques de NEMO examinées in vitro.

Etude des mécanismes de recombinaison génétique chez les rétrovirus. Abdeladim Moumen, Véronique Giacomoni-Fernandes, Roman Galetto et Matteo Negroni

Un des problèmes majeurs rencontrés dans le combat contre le SIDA et contre la diffusion du VIH réside dans la grande variabilité génétique du virus. Une des sources principales de cette variabilité est la recombinaison génétique entre souches virales. Après la première identification en 1995 de séquences de virus recombinants chez des patients, le nombre d'observations indiquant leur existence parmi les formes circulantes de VIH a augmenté de façon surprenante. Il est désormais clair qu'au moins 10 % des virus circulants sont générés par recombinaison entre sous-types viraux. La recombinaison a donc un grand impact sur l'évolution de VIH. Chaque particule virale contient deux copies d'ARN génomique et la recombinaison est essentiellement générée par un changement de matrices entre ces deux ARN (transfert de brin), lors de la transcription inverse.

Nous avons développé un système expérimental, basé sur l'utilisation de marqueurs génétiques, pour étudier in vitro les mécanismes de la recombinaison générée pendant la transcription inverse. Notre travail a montré que la structure de l'ARN génomique constitue le déterminant majeur dans le processus de recombinaison et notamment que les structures en épingle à cheveux constituent des points chauds de recombinaison. Précedemment, nous avions montré que la structure de l'ARN sur lequel la synthèse est transférée (ARN accepteur) constitue le déterminant pour le processus. Nous avons aussi suggéré que la protéine virale nucléocapside (NC), la protéine la plus abondante du complexe de transcription inverse, connue pour augmenter la fréquence de recombinaison in vitro, exerce son effet grâce à son activité de chaperon d'ARN. Ces observations nous ont maintenant permis de formuler un schéma du mécanisme qui pourrait être responsable de la recombinaison à l'intérieur des régions d'ARN génomique repliées en épingle à cheveux. Dans ce modèle, le transfert de brin serait favorisé par un mécanisme ressemblant à la migration de branche qui à lieu pendant la recombinaison entre molécules d'ADN double brin.

Notre travail porte maintenant sur la mise à l'épreuve des différentes étapes du mécanisme qui nous proposons. En parallèle, nous sommes en train de mettre au point un système qui permet d'étudier la recombinaison en culture de cellules (collaboration avec P. Charneau, du groupe de Virologie Moléculaire et Vectorologie, Institut Pasteur). Dans ce modèle expérimental, la réplication virale est limitée à un seul cycle et la recombinaison est étudiée en absence de toute pression de sélection. Ce système expérimental est développé de façon à maintenir une similitude très stricte avec le celui que nous avons utilisé pour l'étude de la recombinaison in vitro, ce qui permettra de comparer les résultats obtenus dans le contexte physiologique constitué par la cellule infectée avec ceux issus des expériences conduites précédemment in vitro.

Mots-clés: NDP kinase, Analogues de nucléotides, Thérapies anti-virales, HIV, Recombinaison, Rétrovirus, NEMO, NF-kB



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  Tran Catherine (cathtran@pasteur.fr) Agou Fabrice, CR IP (fagou@pasteur.fr)

Deville-Bonne Dominique, MC P6 (ddeville@pasteur.fr)

Negroni Matteo, CR IP (matteo@pasteur.fr)

Veron Michel, DR1 CNRS (mveron@pasteur.fr)

Galetto Roman, Post-doc (rgaletto@pasteur.fr)

Gallois-Montbrun Sarah, Thèse (sarahgm@pasteur.fr)

Moumen Abdeladim, Thèse

Pasti Claudia, Thèse

Vinolo Emilie, DEA (vinolo@pasteur.fr)

Traincard François, Ing. Rech. IP (traincar@pasteur.fr)

Giacomoni-Fernandes Véronique, Techn. Sup. IP (verofern@pasteur.fr)

Goffinont Stéphane, Ingénieur AI CNRS

Cortes Marie-Thérèse, Agent de labo IP


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