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Version PDF      Production de Protéines recombinantes et d'anticorps


  Responsable : Béguin Pierre (beguin@pasteur.fr)


  resume

 

Le Plateau Technique n° 5 a pour mission la production et la purification de protéines recombinantes ainsi que la production d'anticorps monoclonaux. Il participe au programme de génomique structurale des Mycobactéries pathogènes. Il produit et caractérise des anticorps monoclonaux pour la recherche, le diagnostic et la thérapeutique



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Le Plateau Technique n° 5 comporte trois modules : a) Production d'anticorps monoclonaux (resp. Farida Nato, fnato@pasteur.fr); b) Production de protéines recombinantes (responsable Jacques Bellalou, bellalou@pasteur.fr); c) Purification de protéines et production de protéines dans le système baculovirus (resp. Pierre Béguin, beguin@pasteur.fr).

Anticorps Monoclonaux

Le module Production d'anticorps monoclonaux assure la préparation d'hybridomes de souris pour les chercheurs de l'Institut et prend également en charge la caractérisation fine de ces anticorps (détermination de classe et sous classe, calcul de constante de dissociation, détermination d'épitopes). Les anticorps monoclonaux présentent un grand intérêt dans certains secteurs de diagnostic et nous ont permis le développement de tests rapides basés sur l'immunochromatographie pour le diagnostic de la peste et du choléra. Ils sont aussi largement utilisés pour analyser la relation structure-fonction de divers modèles étudiés en recherche fondamentale. En effet, la demande peut provenir des groupes dont l'intérêt est l'étude du mode d'entrée de certains pathogènes tels que Listeria monocytogenes ou Shigella flexneri dans les cellules épithéliales. Il s'agit de déterminer la région de la protéine participant à cette entrée. Ce module collabore également avec les groupes qui recherchent les antigènes vaccinants. Il participe aux Projets Transversaux de Recherche. Un autre projet concerne la cartographie des régions exposées de la protéine prion PRPSC de la tremblante du mouton en vue de sa modélisation. Notre rôle consiste à développer des anticorps monoclonaux contre des peptides synthétiques chevauchants afin de pouvoir identifier des épitopes exposés à la surface des fibrilles.

Production de Protéines Recombinantes

Le module Production de protéines recombinantes assure pour les besoins des chercheurs de l'Institut la production de cultures bactériennes en fermenteurs de 1 à 300 litres et la préparation d'extraits bruts à partir des culots de cellules qui en dérivent.

Ce module participe également au programme de génomique structurale des Mycobactéries pathogènes :Mycobacterium tuberculosis et Mycobacterium leprae. Sa tâche consiste à produire à haut débit des culots bactériens contenant des protéines de ces deux organismes produites chez Escherichia coli à partir de gènes portés par des vecteurs d'expression. Afin d'assurer des niveaux de production élevés en protéines recombinantes solubles et correctement repliées, il est nécessaire d'optimiser les paramètres de culture (milieu, température, durée de la phase d'induction des gènes à exprimer) ainsi que les constructions et les souches hôtes exprimant les gènes cibles (co-expression de gènes de chaperons ou de tRNA, souches déficientes en protéases etc.) Une fois les conditions établies pour obtenir les protéines sous forme analysable par RMN ou par cristallographie aux rayons X, celles-ci sont marquées à l'azote 15N ou à la sélénométhionine pour faciliter la détermination de leur structure tridimensionnelle.

Pour répondre à une exigence de production à haut débit dans des conditions standardisées, le module développe un système de cultures en parallèle comportant 8 réacteurs de 60 ml pourvus chacun d'un contrôle de température programmable indépendant. La densité optique de chaque culture est suivie en continu grâce à un capteur optique à défilement. Des microsondes permettent également le suivi du pH et de la pO2. Une interface informatique a été développée pour programmer des protocoles de culture adaptés à la production de protéines recombinantes et minimiser l'intervention de l'opérateur. Une version plus complète de cet appareil intégrera un robot d'injection et de prélèvement d'échantillons programmable asservi à des valeurs de temps ou de densité bactérienne prédéfinies par l'utilisateur.

Purification de Protéines et Production dans le Système Baculovirus

Le module Purification de protéines et production dans le système baculovirus a pour mission du purifier les protéines recombinantes présentes dans les culots bactériens obtenus par le module Production de protéines recombinantes. Cette tâche comprend le suivi des rendements et de la pureté des préparations. A ce titre, il participe au programme de génomique structurale des Mycobactéries Pathogènes : les protéines purifiées sont transmises Plateau Technique n° 6 pour les essais de cristallogenèse et l'analyse par diffraction des rayons X. Les efforts de développement portent sur l'automatisation des procédés (le module dispose d'un système de chromatographie programmable Äkta Explorer) et sur les techniques permettant l'ablation des étiquettes d'affinité.

D'autre part, le module prend également en charge, à la demande, la production de protéines exprimées à partir de baculovirus recombinants dans des cellules d'insectes. Cette tâche comprend la construction du vecteur recombinant par co-transfection et recombinaison in vivo et la production de protéines à partir de cultures infectées. Des cultures stables de cellules transfectées peuvent également être obtenues.

Photo 1 : Batterie de fermenteurs en parallèle pour les cultures bactériennes à haut débit.

Mots-clés: Fermenteurs, protéines recombinantes, cultures automatisées, purification de protéines, baculovirus, anticorps monoclonaux, génomique structurale



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  ESNARD Muriel mesnard@pasteur.fr BÉGUIN Pierre Chef de Laboratoire Institut Pasteur, beguin@pasteur.fr EHSANI Parastoo Stagiaire post-doctorale (Téhéran), pehsani@pasteur.fr BELLALOU Jacques Ingénieur Institut Pasteur, bellalou@pasteur.fr

BONDET Vincent Ingénieur Institut Pasteur (CDD), vbondet@pasteur.fr

FRACHON Emmanuel Ingénieur Institut Pasteur, efrachon@pasteur.fr

MEIER Alain Ingénieur Institut Pasteur, ameier@pasteur.fr

LONGIN Robert Ingénieur Institut Pasteur, rlongin@pasteur.fr

NATO Farida Ingénieur de Recherche Institut Pasteur,fnato@pasteur.fr

DARTEVELLE Sylvie Technicienne Supérieure Institut Pasteur,sdarteve@pasteur.fr

GRÉGOIRE Josiane Technicienne Supérieure Institut Pasteur,jgregoir@pasteur.fr

PETRES Stéphane Technicien Supérieur Institut Pasteur,spetres@pasteur.fr

IDJA Andrée Aide de Laboratoire Institut Pasteur, aidja@pasteur.fr


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