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Version PDF      Puces à ADN


  Responsable : Coppée Jean-Yves (jycoppee@pasteur.fr)


  resume

 

La plate-forme a pour vocation le développement des puces à ADN pour l'étude (génomique comparée et analyse du transcriptome) des microorganismes modèles et des maladies infectieuses. Nous disposons de l'équipement nécessaire à la réalisation et l'utilisation de puces sur membranes Nylon et sur lames de verre. La plate-forme dispose également d'outils statistiques et bioinformatiques nécessaires à l'interprétation des résultats.



  rapport

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La disponibilité des séquences complètes des génomes d'un nombre croissant de microorganismes et les potentialités des nouvelles technologies d'analyse de l'expression des gènes ont incité l'Institut Pasteur à mettre sur pied une plate-forme destinée à la fabrication et à l'analyse des " puces à ADN ". Celle-ci a pour vocation l'étude des microorganismes modèles et des maladies infectieuses. Dans ce dernier cas, nous nous intéressons aussi bien aux agents responsables de ces pathologies (génomique comparée et analyse du transcriptome) qu'à la réponse de l'hôte (analyse du transcriptome). La plate-forme réalise des projets suite à des appels d'offre interne (19 projets ont été retenus suite aux 3 premiers appels d'offre). Ces projets sont en général réalisés sous forme de collaborations. La plupart des projets retenus ont un cadre national ou européen. Le coût de fabrication et de validation des puces est pris en charge (partiellement ou totalement) par la Genopole.

La plate-forme participe à la réalisation des différentes étapes de ces projets :

  • Dessin des amorces et amplifications PCR

  • Purification, quantification et contrôle qualité des PCR

  • Dépôts sur lames de verre et sur membranes Nylon

  • Préparation des cibles (fluorescentes et radioactives) et hybridations

  • Détection des signaux d'hybridation

  • Analyse statistique et interprétation des données

Suite au second appel d'offres de la Génopole (Octobre 2001), 5 projets ont été entrepris au cours de l'année 2002.

Titre

Collaboration

Densité / nombre de supports

Analyse du transcriptome de cellules épithéliales humaines infectées par Shigella flexneri et sa modulation par Lactobacillus

Prof. P. Sansonetti

Unité de Pathogénie Microbienne Moléculaire

1000 PCR / 100 macroarrays

Utilisation d'une approche de transcriptome comparé pour identifier les gènes différentiellement exprimés entre Yersinia pestis et Y. pseudotuberculosis

E. Carniel

Laboratoire des Yersinia

3200 PCR / 20 macroarrays

Puces à ADN et facteurs impliqués dans la virulence de Plasmodium falciparum

Peter H. David

Unité d'Immunologie Moléculaire des Parasites

6000 oligos longs / 300 microarrays

Analyse du transcriptome de la bactérie gram positive Streptococcus agalactiae

P. Glaser

Laboratoire de Génomique des Microorganismes Pathogènes

2100 PCR / 300 macroarrays

Etude de la variabilité génétique chez Mycobacterium leprae

N. Honoré

Unité de Génétique Moléculaire Bactérienne

2000 PCR / 85 macroarrays

Pour les projets qui font appel à la technologie des " macroarrays " (dépôt de fragments PCR sur membranes Nylon et hybridation avec des cibles radioactives) la plate-forme a pris en charge les amplifications PCR (dessin des amorces, réactions d'amplification, contrôle de tous les PCR par électrophorèse en gel d'agarose, contrôle qualité par séquençage de 10 % des produits d'amplification), les dépôts sur membranes et le contrôle qualité des membranes (par hybridation avec un ADN contrôle). Les membranes ainsi réalisées sont actuellement en cours d'utilisation et d'analyse par les équipes de l'Institut impliquées dans ces projets. Les activités de la plate-forme sont essentiellement centrées sur la microbiologie (microorganismes modèles et pathogènes). Néanmoins, une partie des activités de la plate-forme a également été orientée en 2002 vers le développement de puces dédiées aux eucaryotes supérieurs et notamment à l'homme. En effet, il existe une importante demande sur le campus pour le développement de puces permettant d'étudier la réponse de l'hôte à l'infection. Une première puce contenant environ 1000 gènes humains notamment impliqués dans la réponse à l'infection par Shigella flexneri a ainsi été réalisée. Cette puce sera développée pour répondre aux besoins d'autres unités désirant aborder ces thématiques.

Au cours de l'année 2002, nous avons également poursuivi la mise au point et le développement de la technologie des microarrays. Cette mise au point concerne notamment l'utilisation d'oligonucléotides longs au lieu de produits PCR et s'est plus particulièrement effectuée dans le cadre du projet d'analyse du transcriptome de Plasmodium falciparum. Ce projet s'inscrit dans le cadre d'un projet plus large (débutant en Février 2003) regroupant une vingtaine de laboratoires français et du réseau des Instituts Pasteur). Il a notamment pour objectif d'étudier l'évolution du transcriptome en réponse à diverses pressions médicamenteuses, immunes, environnementales ainsi qu'au cours du cycle de développement cellulaire. Un premier jeu de plus de 300 lames a été produit. Il a été utilisé pour étudier l'évolution du transcriptome au cours du cycle cellulaire (cinétiques) et l'effet de certaines drogues. Plusieurs outils d'analyse statistique (normalisation, identification de gènes différentiellement exprimés, regroupement et classification des gènes en fonction de leurs profils d'expression) sont également en cours de développement et de validation sur les données obtenues dans le cadre de ce projet. Par ailleurs, nous développons également, en collaboration avec la plate-forme annotation (PT4), une base de données permettant le stockage et l'analyse des résultats d'expériences de microarrays.

Parallèlement à ces projets, nous assurons également une activité de service. Cette activité est fonction de la disponibilité de nos équipements et du personnel de la plate-forme. Elle consiste en une participation ponctuelle à certains projets (pour lesquels la Génopole ne fournit pas de financement).

La plate-forme assure également une importante activité de formation et d'encadrement pour les personnes de l'Institut désirant utiliser ces technologies. Cette activité s'est traduite également par la participation aux travaux pratiques de deux cours Pasteur (Analyse des Génomes et Génétique Cellulaire et Moléculaire).

Mots-clés: transcriptome, génomique comparée, microarrays, macroarrays, microbiologie, maladies infectieuses



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Luchier, Françoise,fluchier@pasteur.fr   Bischoff Emmanuel, post doc

Dillies, Marie-Agnès, post-doc

Lacourrège Gaëlle, Ingénieur

Tien, Meng-Tesung, étudiant en thèse

Coppée, Jean-Yves, Ingénieur Technologue,jycoppee@pasteur.fr

Lacroix Céline, Technicienne Supérieure de Laboratoire,clacroix@pasteur.fr

Schiavo Angèle, Technicienne de Laboratoire,angsch@pasteur.fr

Sismeiro Odile, Technicienne Supérieure de Laboratoire,osisme@pasteur.fr


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