A l'origine de l'apparition de l'oxygène sur notre planète il y a plus de 3 milliards d'années, les cyanobactéries, par leur activité photosynthétique, participent encore de nos jours au maintien de l'équilibre des proportions entre le CO2 et l'oxygène dans l'atmosphère. Capables de s'adapter à des environnements même extrêmes, elles colonisent la plupart des écosystèmes aquatiques et terrestres. Nombre d'entre elles forment des efflorescences responsables de nuisances dans l'environnement et synthétisent des métabolites secondaires (hépatotoxines et neurotoxines) toxiques pour l'Homme et l'animal. L'objectif de nos travaux de recherche est de développer, par une approche pluridisciplinaire, notre connaissance de la biodiversité, de la physiologie et du génome des cyanobactéries, afin d'élucider leurs modes d'adaptation à l'environnement et les bases de leur toxicité, et d'exploiter leurs potentialités biotechnologiques.

1. La PCC ou "Pasteur Culture Collection of Cyanobacteria" (R. Rippka, I. Iteman, et M. Herdman)

La PCC est internationalement reconnue tant pour la qualité (cultures pures) que pour la diversité des propriétés morphologiques et physiologiques de ses souches.

Les missions de la PCC, qui comprend à la fois des activités de service et de recherche, sont multiples :

1. Préservation et accroissement des ressources biologiques (750 souches représentant 57 genres), avec identification des souches par une approche polyphasique ; en 2002, de nouvelles souches des genres Gloeocapsa et Aphanizomenon (productrice de saxitoxine) ont été introduites dans la PCC ; 475 souches sont disponibles sur catalogue ( http://www.pasteur.fr/recherche/banques/PCC/) ;

2. Distribution et vente de souches (plus de 250 en 2002) à des laboratoires de recherche et des industriels dans le monde entier, ainsi que pour l'enseignement en France, associée à une importante activité de conseil ;

3. Création d'outils moléculaires pour la détection, l'identification et le suivi des cyanobactéries en culture et dans l'environnement ; un test de "capture en plaque" mis au point dans l'Unité a été validé pour les principaux genres toxiques de la PCC ; à l'aide de séquences d'ARN 16S et d'ITS, il est maintenant possible de distinguer les souches planctoniques potentiellement toxiques des genres Planktothrix Oscillatoria. et

4. Valorisation par la recherche et la caractérisation de composés bio-actifs (Collaboration avec V. Bultel, Muséum National d'Histoire Naturelle, Paris) ; Programme Transversal de Recherche sur les "Cyanobacterial neurotoxins and related alkaloids" coordonné par M. Herdman, mise au point d'une méthode de détection des neurotoxines à des concentrations micromolaires ; 10% des souches de la PCC analysées se sont avérées neurotoxiques.

Plusieurs bases de données maintenues dans l'Unité sont en constante évolution :

• "CYANOBANK" (Windows 98, Microsoft Access) : propriétés des souches de la PCC ; "ITS size database" : nombre et taille des amplicons des ITS (300 entrées) ; "Photographic database" : 610 entrées ; "Storage database" : inventaire des souches conservées dans l'azote liquide ; les trois derniers modules interagissent avec CYANOBANK.

• Bases de données indépendantes de CYANOBANK : "ITS sequence database" avec 296 séquences d'ITS de cyanobactéries alignées ; "Cyanobacterial 16S rRNA sequence database", maintenue sous le logiciel ARB avec plus de 900 séquences alignées ; "Bacterial 16S rRNA sequence database", qui permet de choisir des amorces oligonucléotidiques ou des sondes et comprend plus de 13000 séquences ; bases de données (sous GelCompare) des profils RFLP des ITS et des profils obtenus par amplification avec des amorces de type HIP1.

Une activité d'expertise est en place pour l'identification et le dosage des hépatotoxines dans les eaux de surface (Collaboration avec JM Delattre, Institut Pasteur de Lille).

Dans le cadre du contrat européen COBRA "The Conservation of a vital european scientific and biotechnological resource: microalgae and cyanobacteria" (Programme "Quality of Life"), des méthodes de cryopréservation sont actuellement testées, ainsi qu'une technique basée sur l'utilisation des séquences répétées de type HIP1 qui permettra, au moins pour certaines souches, un contrôle rapide de leur identité.

2. Les mécanismes moléculaires de l'adaptation des cyanobactéries à l'environnement (N. Tandeau de Marsac)

La lumière et les nutriments interviennent dans de nombreux circuits de régulation du métabolisme chez les cyanobactéries et jouent un rôle essentiel dans la formation des efflorescences chez les espèces planctoniques.

Les photorécepteurs des cyanobactéries, ancêtres des phytochromes de plantes(Collaborations avec W. Gärtner (Max Planck Institut, Mülheim, Allemagne), B. Quest (Max Planck Institut, Martinsried, Allemagne) et G. Karimova (Biochimie des Interactions Macroméculaires, Institut Pasteur).

Chez Calothrix sp. PCC 7601, deux systèmes de photoperception, les phytochromes CphA et CphB associées respectivement aux régulateurs de réponse, RcpA et RcpB, présentent de fortes similitudes avec les systèmes à deux composants bactériens. In vitro, un chromophore de type phycocyanobiline se fixe de manière covalente sur le résidu Cys259 de la protéine CphA. Dans le cas de CphB, il s'agit d'un chromophore de type biliverdine IXa , lié de manière non covalente à un résidu Leu266. L'holoprotéine CphB récupère des propriétés spectrales voisines de l'holoprotéine CphA, lorsque le résidu Leu266 est remplacé par un résidu cystéinyl. CphA et CphB interviennent dans une étape précoce de la transmission du signal "lumière" par un mécanisme de phosphorylation/déphosphorylation de RcpA et RcpB, respectivement. La structure tridimensionnelle de RcpA et RcpB s'apparente à celle des protéines de la famille des régulateurs de réponse de type CheY, mais elles possèdent un motif de dimérisation qui est nouveau.

Métabolisme du carbone et de l'azote, flottaison et toxicité (Collaboration avec E. Dittmann, Humboldt Universität, Berlin, Allemagne)

Microcystis aeruginosa PCC 7806 est une souche réprésentative des cyanobactéries planctoniques hépatotoxiques qui sous notre latitude, grâce à une abondante synthèse de vésicules à gaz (flotteurs intracellulaires ou GV), forme des efflorescences à la surface des plans d'eau en périodes estivales. Un programme de recherche, visant à établir les relations qui existent entre le métabolisme carbone/azote, la formation des GV et la production des hépatotoxines (microcystines) chez cette souche, a été mis en œuvre. Comme chez les autres souches unicellulaires dulcicoles étudiées antérieurement dans l'Unité, il existe, chez la souche PCC 7806, une protéine PII dont l'état de phosphorylation dépend de la disponibilité en azote et en carbone. Cette protéine est un élément clé d'un système de contrôle qui coordonne le métabolisme de l'azote et du carbone en réponse à des variations des paramètres environnementaux. Ce système comprend également un régulateur transcriptionnel global, NtcA. Un groupe de gènes (gvpA1A2A3CNJKF/L), codant les composants impliqués dan la synthèse des vésicules à gaz, a été caractérisé. Certains de ces gènes forment des opérons dont la transcription est segmentée. Les régions promotrices de certains des gènes gvp, et des modules qui sont impliqués dans la synthèse non-ribosomale des microcystines contiennent un site de liaison à l'ADN pour le régulateur NtcA, suggérant un contrôle de l'expression par l'azote. Les gènes codant les deux sous-unités de la ribulose diphosphate carboxylase/oxygénase (Rubisco), enzyme clé du cycle de Calvin de fixation du CO2, ont également été caractérisés, ainsi qu'un gène codant une protéine similaire à cette dernière ; la structure et la fonction du produit de ce nouveau gène surexprimé chez E. coli sont en cours d'étude.

Génomes cyanobactériens (N. Tandeau de Marsac et I. Iteman)

Le séquençage du génome de la cyanobactérie hépatotoxique Microcystis aeruginosa PCC 7806 est en cours à la génopole de l'Institut Pasteur (Collaborations avec S. Cole et C. Bouchiez, Plate-forme Technique 1-Génomique, et P. Glaser et F. Kunst du Laboratoire de Génomique des Micro-organismes Pathogènes).

Un serveur pour les génomes des cyanobactéries, Synechocystis PCC 6803 et Anabaena PCC 7120, a été mis en place (http://genolist.pasteur.fr/CyanoList/). Une base de données multi-organismes, incluant les génomes de bactéries et de cyanobactéries, est en cours de construction (Collaboration avec I. Moszer, Plate-forme Technique 4-Annotation et Analyse génomique).

L'annotation du génome de la cyanobactérie marine Prochlorococcus SS120 est en cours (Collaboration avec le Génoscope d'Evry). Cette souche se développe à 200 m de profondeur (écotype dit "Low light").Son génome va pouvoir être comparé avec ceux d'autres écotypes du genre Prochlorococcus (MED4 et MIT 9313) et avec celui d'une souche marine du genre Synechococcus WH8102 (séquences sont disponibles au DOE Joint Genome Institute, USA).

Légendes des photos : Cyanobactéries planctoniques toxiques : Oscillatoria PCC 6506, productrice de neurotoxines (à gauche) et Planktothrix PCC 10106, productrice d'hépatotoxines (à droite)

Mots-clés: Collection de cyanobactéries (PCC) , Bases de données , Biodiversité , Toxines , Photoperception et transmission de signaux , Génome