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Version PDF      Plate-forme de microscopie électronique


  Responsable : Marie-Christine PRÉVOST (mprevost@pasteur.fr)


  resume

 

Une activité de recherche et de développement de l'analyse ultrastructurale en biologie cellulaire, virologie et microbiologie sur différentes thématiques en collaboration avec les chercheurs du campus. A cette activité s'ajoute une méthodologie plus spécialisée pour les immunomarquages à l'or colloïdal et les cryofixations.

Une activité de service pour le contrôle de différents échantillons biologiques (cellules, cellules primaires, virus, bactéries, champignons).

Une activité d'enseignement.



  rapport

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La PFME (Plate-forme de microscopie électronique) permet, en priorité, d'offrir à la communauté pasteurienne, la possibilité d'effectuer des études et des travaux sur des sujets pour lesquels l'approche ultrastructurale aura un rôle essentiel dans la thématique de recherche.

Le laboratoire est équipé de 4 microscopes électroniques à transmission (CM10 et CM12 de chez Philips et JEM 1010 et 1200EX de chez Jeol), d'un microscope électronique à balayage à haute résolution (JSM-6700F avec une cathode à émission froide Cold FEG de chez Jeol). Ce microscope à balayage a été installé en novembre 2002. Il nous permet d'obtenir une résolution de 2 à 3 nm à 1Kv pour des échantillons biologiques.

Le laboratoire offre également un ensemble de matériel permettant d'accomplir un éventail assez large de techniques dans différents domaines pour la préparation des échantillons biologiques.

Le plateau technique a également pour mission de former les techniciens, ingénieurs et chercheurs souhaitant s'impliquer dans l'utilisation de façon autonome du matériel. Un cours de formation est mis en place au premier trimestre de l'année 2003.

La plate-forme se propose également, avec l'accord du conseil de stratégie d'orientation et du directeur des plates-formes technologiques, de développer de nouvelles technologies et méthodologies dans des domaines plus pointus de l'analyse ultra structurale telles que les cryotechniques liées à la biologie cellulaire.

Les travaux sont effectués sous forme de contrats de collaboration. Les objectifs sont de définir le ou les projets avec les chercheurs. Les deux parties s'engagent sur les possibilités, risques et orientations technologiques ainsi que sur la confidentialité, les résultats et la reconnaissance extérieure.

Ces collaborations peuvent faire intervenir différents laboratoires et groupes de recherche. Ces contrats de collaboration sont validés par un comité de pilotage mis en place en décembre 2002.

Dans ce cadre, depuis la création de la plate-forme de microscopie électronique, nous avons engagé des collaborations avec différentes unités du campus sur des thèmes divers. Ces thèmes ont nécessité une approche en microscopie électronique aussi bien sur des techniques classiques que sur des techniques plus spécialisées telles que les immunomarquages à l'or colloïdal avec différentes approches (cryocoupes, cryofixation et cryosubstitution).

Les contrats de collaboration sont en constante augmentation.

En 2001, 15 contrats ont été développés. Le bilan est le suivant : 7 contrats sont terminés (2 articles publiés, 2 articles acceptés et 1 article soumis), 7 autres contrats sont en cours et 1 contrat a été arrêté en cours d'année par le responsable du projet.

En 2002, 26 contrats de collaboration ont été initiés.

Voici quelques exemples de projets :

Virologie

Étude sur le VIH: Étude des voies d'entrée du VIH dans des cellules primaires (lymphocytes, macrophages et cellules dendritiques) et rôle de l'entrée par endocytose, phagocytose et macropynocytose. Pour cette étude, nous utiliserons la microscopie ultrastructurale, l'immunomicroscopie et la microscopie électronique à balayage à haute résolution. Collaboration avec le groupe d'Olivier Schwartz, Unité des Virus et Immunité.

Étude sur le VHC : Etude de la possibilité d'assembler en pseudo-particules virales chimères (VLPs) des protéines de capside et d'enveloppe hétérologues dérivées du virus de l'hépatite C et du virus GBV-B (un flavivirus non classé) : Examen par coloration négative et immunomarquage avec des anticorps anti-enveloppe de préparations de VLPs purifiées à partir de cellules d'insecte infectées par des baculovirus recombinants qui expriment les précurseurs structuraux chimères. Collaboration avec le groupe d'Annette Martin, Unité de Génétique moléculaire des virus respiratoires.

Étude sur le virus HTLV-1: Mise au point d'un modèle murin d'infection par le virus chimérique HTLV/MuLV. Dans cette étude, la microscopie électronique a permis de caractériser les particules de virus chimériques dans les surnageants de transfection et les cellules transfectées. Collaboration avec Frédérique Tanguy, Unité des Virus lents.

Contribution du motif PPY des protéines GAG au bourgeonnement du rétrovirus HTLV-1.Collaboration avec I. Leblanc, MC Dokhélar et A Rosenbert, Unité INSERM U332 à l'Institut Cochin.

Médecine moléculaire

Étude sur le VIH: Analyse structurale et localisation cellulaire du complexe de pré intégration HIV muté ou non dans le DNA flap. Nous avons déjà visualisé, par microscopie électronique et immunogold, des structures juste à l'extérieur des pores nucléaires. Nous espérons également visualiser la surface de noyaux purifiés avec la microscopie électronique à balayage à haute résolution qui nous permettra ainsi de faire une analyse immunologique quantitative.Collaboration avec le groupe de Pierre Charneau, Unité de Virologie Moléculaire et Vectorologie.

Pathogénèse microbienne

Étude sur les mycobactéries: Localisation des protéines chez Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, BCG et Mycobacterium segmatis après avoir identifié leur implication dans la virulence et l'antigénicité avec différentes techniques et plus particulièrement leur localisation subcellulaire en immunomicroscopie. Collaboration avec Nadine Honoré, Alexandre Pym, Stewart Cole, Unité de Génétique moléculairebactérienne.

Étude des antigènes Mycobacterium tuberculosis et de leur interaction avec les phagocytes humains et murins par immunomicroscopie. Collaboration avec Brigitte Gicquel, Unité de Génétique mycobactérienne.

Structure et dynamique des génomes

Étude sur la pathogenèse d'Aspergillus fumigatus;: Analyse morphologique de la germination des conidies d'Aspergillus fumigatus après phagocytose par des macrophages alvéolaires de différentes origines (souris, hommes et lignées cellulaires).

Morphologie de mutants d'Aspergillus fumigatus affectés dans la synthèse de la paroi et marquage immunocytochimique des polysaccharides pariétaux chez ces mutants.

Localisation de synthétases et d'hydrolases intervenant dans la synthèse de la paroi cellulaire d'Aspergillus fumigatus.Collaboration avec Jean-Paul Latgé, Unité des Aspergillus.

Parasitologie

Étude de la biologie du noyau d'un pathogène humain Plasmodium falciparum Immunolocalisation de l'enzyme télomérase chez Plasmodium falciparum.Collaboration avec Artur Scherf, Unité des Interactions hôte parasite.

Écosystèmes et épidémiologie des maladies infectieuses

Étude de l'intéraction de Bordetella pertussis avec les cellules trachéales humaines: Analyse structurale du potentiel invasif et de la survie intracellulaire de Bordetella pertusis, Bordetella parapertusisi et Bordetella bronchiseptica.Collaboration avec Nicole Guiso et Pascale Gueirard, Unité des Bordetella.

Immunologie

Étude de la réponse des mastocytes dermiques murins à la piqûre d'anophèle, vecteur de la malaria.: Effet des antigènes salivaires de moustiques sur la dégranulation mastocytaire et le rôle dans la facilitation de l'infection par Plasmodium falciparum chez la souris. Collaboration avec Salah Mecheri et Christian Demeure, Unité d'Immuno-Allergie.

Collaborations Nationales

Rôle des mitochondries dans l'apoptose et localisation des protéines impliquées par immunomarquage à l'or colloïdal.Collaboration avec C. Brenner du CNRS UMR 6022 ( Université de Technologie de Compiègne ) et G. Kroemer CNRS UMR 1599 (Institut Gustave Roussy Villejuif).

Peptides membraniformes antimicrobiens, activité antibiotique et étude ultra structurale de leur interaction avec les membranes microbiennes.Collaboration avec H. Wroblewski de l'Université de Rennes et A. Blanchard de l'INRA de Bordeaux.

ACTIVITÉS DE SERVICE

La plate-forme de microscopie électronique contrôle différents échantillons biologiques (virus, lignées cellulaires primaires et continues, bactéries et champignons). Ces analyses sont faites pour les unités du campus qui ont besoin de ces contrôles afin de poursuivre leurs investigations de recherche.

Nous avons eu également une activité d'expertise pour Texcell ainsi que pour des organismes extérieurs au campus (AFSSA) pour lesquels des échantillons pour la recherche d'entérovirus dans des selles de poulain ont été réalisés.

ACTIVITÉS D'ENSEIGNEMENT

Les différentes techniques de microscopie électronique sont enseignées aux chercheurs, enseignants et techniciens des laboratoires qui souhaitent utiliser ces technologies de façon autonome.

C'est dans cette optique qu'est mis en place le premier module du Cours de formation continue de l'Institut Pasteur les 27 et 28 janvier 2003.

Légende de la photo : Mycobacterium Tuberculosis " H37Rv " cultivé en milieu 7H9. Observé en Microscopie Électronique à Balayage Jeol JSM 6700 F

Mots-clés: Microscopie Électronique, Ultrastructure, Immunomarquage, cryo-coupes, cryo-fixation



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  LHOUMEAU Danièle, dlhoum@pasteur.fr   TORRES Michèle, stage de fin d’année scolaire (préparation d’une maîtrise) PRÉVOST Marie-Christine, Ingénieur technologue position III, Responsable de la Plate-forme de microscopie électronique - mprevost@pasteur.fr

BONNE Isabelle, Ingénieur technologue position II - ibonne@pasteur.fr

BRONNERT Christian, Technicien sup. lab. 2D - cbronner@pasteur.fr

CHAVINIER-JOVÉ Brigitte, Technicienne sup. lab. 1D - bchavijo@pasteur.fr

GIROUX Stéphanie, Technicienne sup. lab 1D - sgiroux@pasteur.fr

SCHMITT Christine, Technicienne de labo. Qual. - cschmitt@pasteur.fr (en congé parental jusqu’au 28 mai 2003)

CAYET Nadège, Technicienne de labo. Qual. (en remplacement de Madame Christine Schmitt)


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