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Version PDF      Parasitologie Biomédicale


  Responsable : Pierre DRUILHE (druilhe@pasteur.fr)


  resume

 

L'unité de Parasitologie Biomédicale vise à une compréhension des interactions immunitaires homme / Plasmodium falciparum, aussi bien au niveau des stades pré-érythrocytaires (sporozoïte et stade hépatique) que du mérozoïte des stades érythrocytaires. Les principales activités ont pour but de faciliter le développement vaccinal et, à moindre degré, de nouveaux médicaments. Nous avons achevé cette années l'analyse du premier essai clinique conduit avec MSP-3 qui a permis d'obtenir des résultats qui sont au delà de nos espérances. En dehors d'essais de phase-I et II avec de nouvelles formulations de MSP-3 et plusieurs formulations de LSA-3, un premier essai clinique en Afrique devrait commencer en 2003 sur la base de l'acquis de 2002.



  rapport

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I — Immunité contre les stades érythrocytaires

Nous avons choisi une approche où les observations cliniques, les interactions entre P. falciparum et l'homme et le matériel biologique dérivé de ces études, sont à l'origine des principaux choix de recherche. Le transfert passif d'une protection clinique par des immunoglobulines d'Africains immuns chez des sujets infectés a permis d'identifier un mécanisme de défense dans lequel les anticorps coopérent avec des monocytes, dénommé ADCI. Ce dernier a été utilisé pour cribler une banque génomique clonée dans un vecteur d'expression et identifier un antigène dénommé MSP-3 , ainsi que d'identifier le rôle critique des anticorps de classes cytophiles, IgG1 et IgG3, seuls capables de coopérer avec des monocytes. Les travaux conduits cette année sont dans le droit fil de cette approche bioclinique d'un vaccin antipaludique. Ils avaient pour but de conforter les évidences en faveur du rôle de MSP-3, de conduire un essai clinique avec cette molécule, d'identifier en détail les épitopes cibles des anticorps protecteurs et d'identfier de nouvelles cibles du même mécanisme de défense.

Le premier essai clinique a été conduit chez 36 volontaires Européens, il s'agissait d'un essai randomisé, à dose croissante, avec 2 adjuvants : l'alun et le Montanide ISA720. Les résultats ont montré une excellente inocuité et immunogénicité et ont fourni de nombreuses informations qui n'étaient pas présivibles d'après les résultats des modèles précliniques. Ainsi, l'alun s'est avéré aussi efficace que le Montanide, alors qu'il était totalement inefficace chez les rongeurs et les primates. Les résultats montrent que l'utilisation d'une molécule simple avec un adjuvant non toxique permet d'induire chez des sujets naïfs un type de réponse immunitaire qui demande 10 ans d'exposition quotidienne à des millions de globules rouges infectés dans les conditions de terrain. Les réponses immunitaires sont dirigées contre des épitopes conservés, sont de longue durée et surtout se sont avérées avoir une activité biologique contre le développement de P. falciparum aussi bien dans des conditions in vitro dans le test d'ADCI que dans des conditions in vivo par transfert passif chez des souris immunocompromises infectées par P. falciparum. L'effet antiparasitaire des anticorps était aussi élevé, et parfois plus élevé, que ceux obtenus avec les anticorps d'adultes Africains immuns qui ont le plus fort état de protection clinique connu contre le paludisme.

En utilisant une série de 6 peptides couvrant la région C-terminale conservée de MSP-3 et 2 recombinants, nous avons caractérisé en détail les épitopes T-helper et les épitopes B dans cette région, avons identifié que 3 parmi les 6 épitopes B non cross-réactifs étaient la cible d'anticorps ayant une activité protectrice, tandis que les 3 restants ne l'étaient pas.

Nous avons identifié une famille multigénique dérivée de MSP-3 par son organisation, ainsi que par la présence de l'un des 3 épitopes B mentionnés ci-dessus, qui sont conservés ou qui ont un très haut degré d'homologie chez les autres membres de cette famille. Nous avons exprimé les protéines recombinantes correspondant d'une part à la région conservée de chacun des membres de cette famille, ainsi que des recombinants correspondant à des régions uniques, de façon à étudier en détail : a) les cross-réactions entre les membres de cette famille et b) l'expression protéique de chaque gène au niveau de la surface du mérozoïte.

Après avoir démontré que GLURP et P126-SERP étaient deux autres cibles du mécanisme d'ADCI, nous avons récemment achevé une étude immuno-épidémiologique détaillée destinée à identifier le rôle respectif dans la protection clinique des anticorps dirigés contre chacune de ces 3 molécules. Les résultats confirment le rôle de chacune de ces cibles dans la protection mais, de plus, démontrent qu'elles peuvent avoir une fonction complémentaire en particulier dans les zones de transmission méso- à hyperendémique, où les anticorps dirigés contre 1 ou 2 de ces cibles peuvent prendre le relais en cas d'absence de réponse à la 3ème et vice versa.

Nous avons aussi identifé un nouvel antigène qui pourrait être une 4ème cible du même mécanisme et avons exprimé 3 régions de cette molécule sous forme recombinante de façon à pouvoir effectuer des études in vitro et in vivo de l'activité biologique des anticorps correspondants et des études immuno-épidémiologiques de leur rôle dans la protection acquise.

Nous avons ausis initié cette année une étude de l'affinité des anticorps contre les 3 cibles de l'ADCI ci-dessus. Bien que celle-ci ne soit pas achevée, elle a révélé des différences majeures dans l'affinité des anticorps chez divers individus, en particulier chez les sujets non protégés par rapport aux sujets protégés contre le paludisme.

Nous avons produit un anticorps humain recombinant dirigé contre MSP-3-b, et avons démontré cette année son activité biologique par transfert passif chez la souris immunocompromise infectée par P. falciparum. Le rôle de la chaîne lourde a été analysé en comparant l'activité du même Ac humain exprimé soit sous forme d'IgG1, soit d'IgG3. Nous avons réalisé à la fin de l'année 2002 un essai de transfert passif de ces anticorps chez le chimpanzé infecté par P. reichenovii, qui a 100 % d'homologie dans les épitopes-cibles de MSP-3. Nous étudions à présent la possibilité de développer cet anticorps humain recombinant à un faible coût en l'exprimant dans des plantes.

Nous avons entrepris une étude systématique du mécanisme d'ADCI aussi bien au niveau du bras afférent, c'est à dire de la liaison par l'anticorps cytophile entre la surface du mérozoïte et le récepteur Fc du monocyte, que du bras afférent, c'est à dire des médiateurs relargués par le monocyte et de leur effet sur les parasites au niveau intra-érythrocytaire. Ce travail a déjà conduit à des améliorations majeures dans la standardisation du test d'ADCI, le développement d'une méthode à haut débit adaptée au criblage des nouvelles molécules dérivées du projet génome et une analyse de l'influence de la structure du fragment Fc de l'IgG1, de l'IgG3, des divers allotypes existants dans diverses populations et de la structure du récepteur Fc- R2.

II — Stades pré-érythrocytaires

Nous avons démontré que ce qui a été considéré longtemps comme une " immunité anti-sporozoïte " est en fait lié au développement d'un trophozoïte intra-hépatique et avons de ce fait focalisé nos efforts sur l'étude de l'immunité contre les schizontes hépatiques. La molécule leader LSA-3 a été identifiée par criblage différentiel par les réponses immunitaires de sujets protégés ou non protégés ayant été immunisés par sporozoïtes irradiés. Nous avons récemment achevé la caractérisation de 29 nouveaux antigènes pré-érythrocytaires.

Nous avons démontré cette année le rôle protecteur d'un nouvel antigène pré-érythrocytaire dénommé LSA-5 qui est capable d'induire une réponse protectrice chez le singe Aotus contre un challenge par des sporozoïtes virulents de P. falciparum.

Simultanément, nous avons obtenu de nouvelles évidences en faveur du rôle protecteur de la molécule leader LSA-3, par l'immunisation de singes Aotus avec 2 très longs peptides synthétiques adjuvés par ASO2 de chez GSK. Ceci porte à 5 le nombre de modes de présentation de cet antigène utilisés chez le primate, qui ont permis d'induire une protection contre un challenge massif par sporozoïtes de P. falciparum.

Nous avons étudié en détail plusieurs modifications du protocole de culture des schizontes hépatiques in vitro, qui a permis d'effectuer un progrés drastique dans le nombre de parasites obtenus, ouvrant de ce fait de nombreuses voies de recherche jusqu'à présent inaccessibles. Ces progrès ont commencé à être appliqués d'une part à l'analyse des mécanismes de défense contre la phase intra-hépatique et d'autre part à l'élucidation du transcriptome des stades hépatiques, la phase la plus méconnue du cycle de Plasmodium.

Récemment, des ARN messagers ont pu être préparés à partir de ces cultures, un banque de cDNA préparée pour les stades hépatiques de P.yoelii et 2200 clones séquencés à la Génopole pour générer 400 nouvelles séquences de ces stades. Nous préparons une approche similaire pour construire une banque de cDNA des stades hépatiques de P. falciparum.

En collaboration avec d'autres groupes de recherche, il avait été montré qu'il existe une expression stade-spécifique d'une famille multigénique, P.yoelii 235, c'est à dire capable d'exprimer un certain répertoire de gènes au stade érythrocytaire et un autre au stades sporozoïte et / ou au stade hépatique. Nous essayons à présent d'exploiter cette observation pour analyser les mécanismes moléculares contrôlant l'expression génique chez Plasmodium. Le répertoire de la famille Py235 a été plus amplement caractérisé. Des régions attentantes au gène isolé et clonées avec un gène codant pour la GFP. La transfection de P.yoelii et l'expression transitoire dans les stades hépatiques ont été obtenues.

Dans le cadre d'un projet financé par PAL+, la diversité des épitopes T-helper de la CircumSporozoïte protéine de P. falciparum a été analysée et a révélé une distribution qui est extrêmement restreinte. Des études similaires sont actuellement menées dans deux sites africains pour analyser les raisons de ce déséquilibre observé en Asie.

Enfin, nous avons continué à progresser dans l'étude des greffes d'hépatocytes humains chez les souris immunocompromises en utilisant le modèle BXN, le modèle SCID-NOD, le modèle UPA-SCID et le modèle FAH-Rag 2.

Mots-clés: clés Plasmodium falciparum, immunité, vaccins, merozoite, stades hépatiques, régulation de l’expression



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