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Version PDF      Mycologie Moléculaire


  Responsable : DROMER Françoise (dromer@pasteur.fr)


  resume

 

Une meilleure connaissance de l'interaction entre l'hôte et les champignons pathogènes pourrait améliorer le pronostic des mycoses systémiques. Nous centrons nos recherches sur la pathogénicité de Cryptococcus neoformans et de Candida albicans par une approche simultanée de l'hôte (études cliniques et épidémiologiques, modèles animaux) et du pathogène (facteurs de virulence, variabilité).



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Cryptococcus neoformans

L'étude de la physiopathologie des cryptococcoses et des mécanismes de virulence de Cryptococcus neoformans représente à terme les meilleurs moyens d'améliorer la prise en charge des patients atteints de cryptococcose, en nombre important puisque cette infection opportuniste touche au moins 25% des patients infectés par le virus de l'immunodéficience humaine en zone tropicale. C. neoformans est une levure basidiomycète capsulée qui provoque des méningo-encéphalites de pronostic sévère malgré les traitements antifongiques (³ 20% de mortalité précoce), ce qui justifie la recherche de mesures thérapeutiques ou prophylactiques nouvelles.

Capsule de C. neoformans (G. Janbon, F. Moyrand)

Chaque cellule de C. neoformans est entourée d'une capsule polysaccharidique qui représente le facteur de virulence principal. Ainsi, les souches acapsulées sont avirulentes et la capsule a un effet délétère sur la réponse immunitaire. L'utilisation d'anticorps monoclonaux spécifiques nous a permis d'observer une grande variabilité de structure d'une cellule à l'autre au sein d'une même population cellulaire. Notre hypothèse de travail est que la variabilité de la structure de la capsule est, au moins pour une part, responsable de la virulence de C. neoformans. Alors que les mécanismes et les déterminants génétiques de la variabilité antigénique sont connues pour de nombreux micro-organismes procaryotes et eucaryotes, aucune étude n'a été menée en ce sens chez les champignons pathogènes. Nous avons cloné des gènes codant pour divers éléments de la voie de biosynthèse du polysaccharide capsulaire et étudions les mécanismes qui sont responsables de la variabilité de sa structure. Un programme de disruption systématique des gènes potentiellement impliqués dans la synthèse des polysaccharides capsulaires vient d'être lancé et devrait aboutir, en deux ans, à la construction de 150 souches mutantes.

Etude d'une protéine de C. neoformans impliquée dans la réponse humorale au cours de la cryptococose (F. Dromer, S. Jacquelin, J. Lemay)

En analysant la réponse humorale chez les souris inoculées par C. neoformans, nous avons mis en évidence l'existence d'anticorps préférentiellement produits par les animaux qui survivaient à l'infection. Nous avons identifié l'une des protéines impliquée dans cette réponse humorale, et cloné le gène PEP1. Notre objectif est de rechercher si la présence d'anticorps spécifiques est prédictive du pronostic de l'infection chez l'homme et d'étudier le potentiel vaccinal de cette protéine. Ce projet fait l'objet de ollaborations vec JL Guesdon et Sylvie Rouyre (Ingéniérie des Anticorps) et Y. Germain (IP Bangui) (PTR58). Après production de la protéine recombinante, nous avons mis au point deux tests immuno-enzymatiques (ELISA et immuno-empreinte) et sommes en train d'analyser la réponse humorale anti-GXM et anti-Pep1p des patients atteints de cryptococcose. Par ailleurs, plusieurs anticorps monoclonaux spécifiques de divers épitopes de cette protéine ont été générés en utilisant les cellules spléniques de souris immunisées ou survivant à l'infection par C. neoformans. Leur efficacité et celle de la protéine recombinante vont être testées dans le modèle expérimental de cryptococcose disséminée.

Cryptococcoses humaines (F. Dromer, O. Lortholary, L. Improvisi, O. Ronin).

Une étude prospective clinique multicentrique nationale (étude Crypto A/D) sur la physiopathologie des infections dues à C. neoformans a été mise en place en avril 1997. Cette étude a permis de rassembler des données cliniques et épidémiologiques sur 230 patients infectés par C. neoformans, avec ou sans co-infection par le VIH. En parallèle, les souches ont été conservées pour typage et des liquides biologiques ont été prélevés à des temps importants du traitement. Nous avons récupéré les dernières données manquantes et allons débuter l'analyse.

L'étude de la réponse immunitaire plasmatique (cytokines pro- et anti-inflammatoire) de patients atteints de cryptococcose (75 patients infectés par le VIH et de 14 patients séronégatifs) est faite en fonction de la dissémination de l'infection, du sérotype infectant et du statut immunitaire de l'hôte. Nous avons pu démontrer que l'infection par le VIH était associée à une réponse inflammatoire augmentée dans le plasma des patients SIDA fongémiques par rapport à ce qui était observé sur d'autres terrains immunitaires et contrairement à ce que nous avons observé dans le LCR. Ces résultats sont un argument supplémentaire pour la compartimentalisation de la réponse immunitaire au cours de la cryptococcose humaine comme nous l'avons montré dans notre modèle expérimental (responsable O. Lortholary).

Depuis juin 2001, une étude observationnelle des conditions d'arrêt de la prophylaxie secondaire de la cryptococcose chez 280 sujets infectés par le VIH et traités par une thérapeutique antirétrovirale hautement active a été mise en place et sera analysée dans le courant de l'année 2003 (responsable O. Lortholary, collaboration INSERM U330 Bordeaux).

Candida albicans

Candida albicans, une levure ascomycète saprophyte du tube digestif, est le deuxième microorganisme étudié dans l'Unité de Mycologie Moléculaire. Cette levure est responsable d'infections sévères chez des patients immunodéprimés par des chimiothérapies aplasiantes, des transplantations d'organes ou de moelle osseuse, mais aussi d'infections nosocomiales dans des services de réanimation.

Etude de la biosynthèse des b1,2 oligo mannosides chez C. albicans (G. Janbon, C. Mille)

Le contact entre C. albicans et les cellules de l'hôte se fait au niveau de la paroi du champignon. Celle-ci est principalement composée de glucanes (polymères b-1,3 et b-1,6 de résidus glucose), de mannanes (polymères a-1,2 et a-1,3 de résidus mannose) et de mannoprotéines. En plus de ces polymères a de résidus mannose, des b-1,2 oligomannosides sont associés soit aux mannoprotéines pariétales soit au phospholipomannane (PLM). De nombreuses études ont montré que la présence de ces résidus était associée à la virulence de C. albicans. Alors que les voies de biosynthèse des b-glucanes et les mannoprotéines sont au moins partiellement connues, aucun gène participant à la synthèse des b-1,2 oligomannosides n'a été identifié que ce soit au niveau du PLM ou de la paroi. En étroite collaboration avec le laboratoire de D. Poulain à Lille, nous avons identifié des gènes nécessaires à la synthèse des b-1,2 oligomannosides chez C. albicans, Candida glabrata et Saccharomyces cerevisiae en vue de déterminer l'influence de ces résidus sur la physiopathologie des infections.

Prévention de la colonisation digestive par des sucres synthétiques mimant les b-1,2 oligomannosides de C. albicans (F. Dromer, L. Improvisi)

Dans le cadre d'une collaboration avec l'équipe de D. Poulain (Lille) et de J.-M. Mallet (ENS, Paris), nous avons mis au point, au laboratoire, le modèle de colonisation digestive du souriceau nouveau-né par C. albicans. Nous avons démontré que l'administration orale de b-1,2 oligomannosides synthétiques mais pas celle de a-1,2 oligomannosides prévenait de façon dose-dépendante la colonisation ultérieure par les levures. Cette démonstration de la capacité d'une adhésine fongique à prévenir la colonisation digestive ouvre la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Etude de la formation de biofilms chez C. albicans et C. glabrata (G. Janbon, F. Dromer, I. Iraqui)

Les biofilms sont des structures tri-dimensionnelles de micro-organismes qui se développent sur différents supports. En ce qui concerne les Candida, ces structures peuvent se développer sur les cathéters ou encore sur des prothèses et sont certainement des sources de réinfection après un traitement antifongique. L'objectif de ce projet est donc de déterminer les mécanismes moléculaires de la formation de biofilms à Candida. Ce projet fait l'objet d'un PTR avec les groupes de C. D'enfert (UP Biologie et Pathogénicité fongiques) et de JM Ghigo (G5, Génétique des Biofilms) (PTR50). Nous avons isolé un grand nombre de mutants de C. glabrata ne formant plus de biolfilms et sommes en train d'isoler les gènes correspondants. Par ailleurs, nous avons commencé à déléter des gènes de C. albicans dont l'expression est induite lors de la formation des biofilms et identifiés grâce à l'étude du transcriptome.

Centre National de Référence Mycologie et Antifongiques (F. Dromer, O. Lortholary).

Les nouvelles missions du CNRMA sont très variées. Elles impliquent d'une part, une expertise dans le domaine de l'identification des levures et des champignons filamenteux pathogènes (J.-C. Gantier, D. Garcia-Hermoso, O. Ronin), leur typage moléculaire (S. Bretagne, D. Garcia-Hermoso), et les tests de sensibilité aux antifongiques (D. Garcia-Hermoso, O. Ronin), ainsi que dans la prise en charge des patients suspects ou atteints de mycoses sévères par le biais de conseils, et d'autre part, la surveillance épidémiologique des mycoses sévères, rares ou exotiques, et de la résistance aux antifongiques.

L'Observatoire des Levures a été mis en place, sur la région parisienne dans un premier temps, pour surveiller les infections et caractériser, au cours du temps, les espèces de levures responsables de fongémies (typage, profil de sensibilité).

L'étude de l'efficacité des associations doubles ou triples d'antifongiques sur Aspergillus fumigatus est également entreprise in vitro et in vivo dans le but d'améliorer, à terme, le pronostic encore très sévère des aspergilloses invasives (E. Dannaoui). L'effet de l'association des nouvelles molécules (échinocandines, nouveaux antifongiques azolés) ou de molécules de référence est ainsi déterminé en milieu liquide par la méthode de l'échiquier et in vivo dans un modèle d'aspergillose disséminée. L'efficacité de certaines associations est également testée in vitro sur C. neoformans en utilisant des techniques variées (E. Dannaoui, P. Schwarz).

Mots-clés: Cryptococcus neoformans, capsule, Candida albicans, polysaccharide, mycologie, physiopathologie, antifongiques, biofilms



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Edith MARTIN,emartin@pasteur.fr DROMER, Françoise, IP, chef de laboratoire,dromer@pasteur.fr

JANBON, Guilhem, IP, chargé de recherches,janbon@pasteur.fr

LORTHOLARY, Olivier, AP-HP, olivier.lortholary@avc.ap-hop-paris.fr

GANTIER, Jean-Charles, Pr. des Universités, jc.gantier@cep.u-psud.fr

BRETAGNE, Stéphane, PU-PH, bretagne@univ-paris12.fr

MILLE, Céline, thèse

LEMAY, Julie,jlemay@pasteur.fr

CHARLIER, Caroline,charlier@pasteur.fr

DANNAOUI, Eric,dannaoui@pasteur.fr

IRAQUI, Ismaïl,iiraqui@pasteur.fr

SCHWARZ, Patrick,pschwarz@pasteur.fr

IMPROVISI, Luce, ITA

JACQUELIN, Sébastien, technicien

MOYRAND, Frédérique, ITA,

RONIN, Olivier, ITA,oronin@pasteur.fr

GARCIA-HERMOSO, Dea, Ingénieur technologue,dea@pasteur.fr

ANFRY, Lucile, agent de laboratoire

TOURNAIRE, Marc, aide de laboratoire


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