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Version PDF      Membranes Bactériennes


  Responsable : WANDERSMAN Cécile (cwander@pasteur.fr)


  resume

 

L'unité des Membranes bactériennes étudie les transports membranaires chez les bactéries à Gram négatif en développant trois thématiques de recherche : l'acquisition de l'hème dépendante d'hémophore, la sécrétion de protéines dépourvues de peptide signal par les transporteurs ABC et un système à deux composants impliqué dans l'acquisition du fer.



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1) Systèmes d'acquisition de l'hème dépendant d'hémophores (Sylvie Létoffé, Laurent Debarbieux, Philippe Delepelaire, Francis Biville, Annick Paquelin, Frédéric Huché, Virginie Roussel).

Le fer est indispensable à la vie cellulaire comme cofacteur de nombreuses enzymes. Cependant, il n'est pratiquement pas disponible pour les bactéries ni dans l'environnement où il forme des polymères insolubles, ni dans les organismes hôtes où il est lié à des ferri-protéines et des hémoprotéines. Les bactéries possèdent de nombreux systèmes d'assimilation du fer dont la variété et la coexistence chez une même espèce reflètent la variété des situations que rencontrent les microorganismes.

Les systèmes d'acquisition de l'hème et des hémoprotéines sont classés en deux groupes: ceux faisant intervenir des récepteurs de membrane externe qui reconnaissent directement l'hème et les hémoprotéines comme l'hémoglobine ou l'hémopexine, et ceux qui dépendent de petites protéines extra cellulaires appelées hémophores qui fixent l'hème libre ou lié à des hémoprotéines avec une très grande affinité puis le retournent à des récepteurs spécifiques. Les hémophores aussi appelés HasA forment une nouvelle famille d'hémoprotéines sans homologie avec d'autres protéines connues. Ces hémophores que nous avons d'abord identifiés chez S. marcescens sont également présents chez d'autres espèces bactériennes (Pseudomonas. aeruginosa , Pseudomonas fluorescens, Yersinia pestis et Yersinia enterocolitica). Le système Has de S. marcescens (Fig1) comprend HasR, le récepteur de l'hémophore, HasA, l'hémophore, hasD et HasE les protéines de membrane interne du transporteur de l'hémophore et HasB, un homologue de TonB. Toutes ces protéines sont codées par des gènes regroupés en un opéron régulé par le répresseur Fur en présence de fer. La structure tridimensionnelle de l'holoprotéine (Fig.2) ainsi que la mutagenèse en alanine des résidus ligands axiaux du fer ont montré que le fer de l'hème est lié par l'histidine 32 et la tyrosine 75. Une deuxième histidine (83) forme une liaison hydrogène avec la tyrosine 75 et peut devenir ligand de l'hème après mutagenèse des deux autres résidus. Ces études sont faites en collaboration avec le groupe de RMN de l'Institut Pasteur. L'apo et l'holo-hémophore se fixent avec des affinités semblables (5nM) sur le récepteur à un même site ou à des sites chevauchants. Ce site sur HasA est constitué de deux domaines de liaison, chacun situé sur un feuillet beta de la protéine (étoiles sur la fig.2). Nous faisons l'hypothèse que la fixation de l'hémophore par ses deux sites de liaison déforme la protéine de telle façon qu'elle libère son hème.

Le transport de l'hème à travers le récepteur HasR utilise l'énergie dérivée de la force proton motrice de la membrane interne et dépend du complexe TonB-ExbBD, qui transmettrait cette énergie. C'est une propriété commune à de nombreux récepteurs de la membrane externe dont la structure tridimensionnelle a été déterminée dans quelques cas et montre un domaine N-terminal périplasmique fermant le tonneau beta du récepteur, et pouvant entrer en interaction avec la protéine TonB.

Alors que l'hème libre est transporté tel quel, l'utilisation de l'hème lié à l'hémophore nécessite l' extraction de l'hème de la protéine porteuse. Ceci entraîne la rupture d'une liaison de haute affinité entre la protéine et son groupement prosthétique. On ne sait pas si cette étape requiert de l'énergie et le complexe TonB-ExbBD . Nous venons de montrer que l'extraction de l'hème de l'hémophore nécessite une plus grande concentration en complexe TonB-ExbBD que l'acquisition directe sans l'intervention d'hémophore. Ainsi, les deux étapes sont toutes deux dépendantes de TonB et dissociables en terme de besoins en complexe TonB-ExbBD. Le déchargement de l'hème des hémoprotéines est un processus qui intervient dans de nombreuses régulations chez les eucaryotes et dans le recyclage hépatique de l'hémopexine, transporteur sérique de l'hème. Les mécanismes de déchargement sont peu compris et nous espérons que HasA pourra servir de système modèle dans ces études. Nous avons de nombreuses collaborations sur ce sujet en particulier avec W. Welte en Allemagne pour déterminer par rayons X la structure 3D du complexe hémophore-récepteur.

Deux gènes régulateurs hasI and hasS sont localisés en amont de l'opéron has dans une unité de transcription régulée par le fer et codent respectivement pour un facteur sigma et son anti-sigma. La fixation de l'hémophore chargé d'hème sur le récepteur HasR induit l'opéron has alors que l'hème seul ne l'induit pas. Ceci montre que l'inducteur et le substrat transporté sont des molécules différentes. Comme l'inducteur est une molécule produite par la bactérie, qui induit de l'extérieur, on peut considérer ce système comme une sorte de quorum sensing.

L'analyse du génome de Yersinia enterocolitica montre la présence d'un opéron has très conservé avec quatre gènes homologues à hasA. Nous tentons de comprendre la signification physiologique d'une telle redondance.

2) La sécrétion des protéines par les transporters ABC (Guillaume Sapriel, Sandra Cescau, Laurent Debarbieux et Philippe Delepelaire).

La voie ABC (pour ATP Binding Cassette) ou voie de type I est l'une des quatre voies majeures de sécrétion des protéines actuellement connues chez les bactéries à Gram négatif. Comme la voie III, la voie I ne fait intervenir ni peptide signal N-terminal ni appareil de sécrétion Sec. Elle est donc indépendante du plus universel mécanisme de translocation des polypeptides.

De nombreuses protéines telles que des hémolysines, des bactériocines, des protéases, des lipases, des protéines de couche S et des hémophores empruntent la voie I qui est caractérisée par la présence, dans le transporteur, d'une ATPase membranaire appelée protéine ABC. Ces protéines sont impliquées dans de très nombreux transports membranaires dont certains sont essentiels à la vie cellulaire. Etant donné leurs fonctions capitales, il n'est pas surprenant, grâce aux progrès de la génétique humaine, de voir ces protéines associées à un nombre sans cesse croissant de maladies héréditaires graves. L'utilisation de drogues anti-tumorales et d'antibiotiques a aussi favorisé la sélection de protéines ABC fonctionnant comme pompes d'efflux de ces agents thérapeutiques chez les procaryotes et les eucaryotes. Les multirésistances qui en découlent sont une menace importante de santé publique.

Notre équipe a montré que cette voie permet la sécrétion de protéines de fonction et d'origine très diverses ayant toutes un signal C-terminal. Puis nous avons établi que les transporteurs comprennent outre la protéine ABC, deux autres protéines de l'enveloppe bactérienne dont une protéine de la membrane externe appartenant à la famille TolC , une protéine multifonctionnelle nécessaire à l'efflux des drogues et des sels biliaires (Fig.1).

Le signal de sécrétion C-terminal reste exposé sur la protéine grâce à des chaperons cytoplasmiques nécessaires à la sécrétion. Ce signal reconnaît la protéine ABC, module l'hydrolyse de l'ATP et induit la formation d'un complexe multiprotéique. L'interaction entre protéine ABC et substrat implique plusieurs sites que nous tentons de caractériser. L'identification de ces sites pourrait initier une recherche de drogues inactivant des protéines ABC impliquées dans la résistance à de nombreux agents thérapeutiques.

Nos futures recherches s'orientent d'une part vers le rôle des chaperons et l'état conformationnel des exoprotéines compatible avec la sécrétion, d'autre part vers la structure et la dynamique d'association du transporteur en un complexe multiprotéique. Nous nous tournons vers des approches biophysiques pour visualiser ces complexes purifiés: cryomicroscopie et cristallisation. Pour cela nous avons entrepris des collaborations avec les groupes de Glaeser à Berkeley USA, de T. Rappoport à Harvard USA.

3) Système à deux composants impliqué dans le contrôle de l'acquisition du fer (Francis Biville)

Ce système est présent chez de nombreuses bactéries. YgiY présente des homologies de séquence avec les kinases, senseurs membranaires des systèmes à 2 composants et YgiX avec les activateurs transcriptionnels phosphorylables. Chez E. coli, ce système est impliqué dans la régulation de nombreuses fonctions telles que la motilité, la formation de biofilms et l'acquisition du fer. Nous avons montré que l'inactivation de YgiY permet l'utilisation du fer complexé au pyrophosphate en l'absence d'enterobactine qui extrait le fer lié au pyrophosphate. Ceci suggère que YgiY/ YgiX régule un système d'acquisition du fer non encore identifié. YgiYpossède un motif EXXE présent sur plusieurs protéines fixant le fer. Nous testons actuellement si YgiY peut fixer du fer radioactif.

Photo 1 : Système d'acquisition de l'hème dépendant d'hémophore S. marcescens

Photo 2 : Structure tridimensionnelle d'hémophore S.marcescens .

Mots-clés: Transport membranaire, acquisition du fer, hémophore, protéine ABC



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  THEPAUT Sylvana, sthepaut@pasteur.fr BIVILLE Françis, Chargé de Recherche IP, fbiville@pasteur.fr

DEBARBIEUX Laurent, Chargé de Recherche IP, deblaure@pasteur.fr

DELEPELAIRE Philippe, DR2 CNRS, pdelep@pasteur.fr

WANDERSMAN Cécile, Chef d'Unité IP, cwander@pasteur.fr

CESCAU Sandra, Etudiante Doctorat Université Paris 7, scescau@pasteur.fr

HUCHE Frédéric, Etudiant Doctorat Université Paris 7/ Boursier Univ.Constance, huche@pasteur.fr

ROUSSEL Virginie, Etudiante DEA Université Paris 6, vroussel@pasteur.fr

LETOFFE Sylvie, Ingénieur IP, sletoffe@pasteur.fr

PAQUELIN Annick, Technicienne CNRS, apaquel@pasteur.fr

GUICHARD Fernande, Agent de laboratoire IP, fguichar@pasteur.fr

LEBON Gisèle, Aide de laboratoire IP, glebon@pasteur.fr

MALBERT Marie-Jeanne, Aide de laboratoire IP, mjmalber@pasteur.fr

RAJARATNAM Thomas, Responsable de préparation IP, tomaraja@pasteur.fr

THEPAUT Sylvana, Secrétaire IP, sthepaut@pasteur.fr


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