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Version PDF      Référence des Mycobactéries


  Responsable : Véronique Vincent (vvincent@pasteur.fr)


  resume

 

De nouveaux outils génétiques et immunologiques ont été décrits au sein du laboratoire : caractérisation des différentes espèces de bacilles de la tuberculose, démonstration que la mannosylation de certaines protéines est déterminante pour leur antigénicité. Ces molécules spécifiques sont utilisées pour mettre au point de nouvelles techniques de diagnostic de la tuberculose.



  rapport

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Centre National de Référence (Gilles Marchal, Véronique Vincent, Cristina Gutierrez-Perez, Anne Varnerot, Maria de Moura Goncalves, Nathalie Barilone, Cyril Depozat)

Le Laboratoire est Centre National de Référence des Mycobactéries et est à ce titre impliqué dans la surveillance épidémiologique de la tuberculose et des autres infections mycobactériennes. La surveillance de la transmission de la tuberculose multi-résistante, c'est-à-dire des cas de tuberculose à traitement difficile car privé des antituberculeux majeurs isoniazide et rifampicine, est assurée par le typage systématique des souches. Le typage met en évidence des groupes de transmission à faible effectif, limités généralement à 2 patients, ce qui indique une bonne prise en charge des patients et un contrôle efficace de la transmission. Cependant des patients chroniques contribuent à l'extension de la maladie dans la communauté. Ces données sont intégrées à un réseau européen de surveillance de la tuberculose multi-résistante.

Membre du réseau OMS de laboratoires supra-nationaux, le CNR est l'un des coordinateurs du sous-réseau européen pour la surveillance de la résistance aux antituberculeux au niveau mondial. Le CNR a ainsi participé aux enquêtes des programmes nationaux de lutte antituberculeuse à Madagascar et Djibouti. L'étude de Djibouti montre que le traitement antituberculeux reste efficace chez les séropositifs à VIH et que sous traitement supervisé il n'y a pas d'émergence de multi-résistance. Une vaste étude de la tuberculose multi-résistante est menée au sein du réseau des Instituts Pasteur et associe les Instituts Pasteur d'Algérie, Maroc, Centrafrique, Cameroun, Côte d'ivoire, Madagascar, Viet-Nam et Saint Petersbourg. La première phase de l'étude montre la forte prévalence en Russie et au Viet-Nam de la famille de souches Beijing, caractérisés par de fortes similarités génotypiques et une corrélation avec l'accumulation de résistances aux antituberculeux. Des souches de type ancestral sont principalement détectées à Madagascar, une caractéristique liée à l'histoire de la population humaine de la Grande Ile avec une immigration du Sud-Est asiatique.

Epidémiologie moléculaire et phylogénie de M. tuberculosis (Cristina Gutierrez-Perez)

En collaboration avec l'équipe de S. Cole, nous avons évalué l'intérêt épidémiologique de nouveaux marqueurs moléculaires pour le typage et la phylogénie des souches du complexe de la tuberculose. Les régions génomiques délétées au cours de l'évolution des bacilles représentent des marqueurs spécifiques utiles à l'identification de M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum et des autres espèces de bacilles de la tuberculose. Une étude de souches proches de l'ancêtre commun à toutes ces espèces est en cours au laboratoire.

Phylogénie de M. marinum et M. ulcerans (Véronique Vincent, Cristina Gutierrez-Perez). M. marinum, agent d'infection cutanées bénignes, et M. ulcerans, agent d'ulcères nécrosants endémiques en Afrique sub-saharienne et en Australie, sont phylogénétiquement proches et l'identification différentielle peut s'avérer difficile. La séquence répétée IS2404, spécifique de M. ulcerans, a été détectée chez une souche aux caractéristiques phénotypiques et à la composition en lipides proches de celles de M. marinum. Cette souche pourrait représenter le chaînon manquant entre M. marinum et M. ulcerans car seules quelques copies de IS2404 y sont retrouvées alors que M. ulcerans en héberge plus d'une centaine.

Mycobactéries et eau potable (Corinne Le Dantec, Véronique Vincent)

L'étude des mycobactéries dans l'eau de distribution met en évidence une flore variée avec des résistances au chlore très élevées, de 100 à 330 fois plus élevées que E. coli. Les conditions d'inactivation montrent que l'augmentation de température et la baisse de pH permettent une meilleure inactivation. L'étude de la flore mycobactérienne aux différents stades de la filière de production d'eau potable a montré que les mycobactéries peuvent coloniser les filtres de charbon actif et pénétrer dans les systèmes de distribution. Les espèces mycobactériennes retrouvées dans les réseaux internes diffèrent de celles retrouvées en sortie d'usine de production suggérant l'importance des biofilms dans la colonisation des réseaux intérieurs.

Réponses immunitaires au cours de la tuberculose

Une réponse immunitaire protectrice contre une infection expérimentale par M. tuberculosis ne peut être obtenue que par l'injection d'un vaccin vivant. La souche de virulence atténuée de M. bovis, BCG, est ainsi utilisée comme vaccin contre la tuberculose. Deux thèmes majeurs de recherche ont été explorés au cours des dernières années. L'efficacité de l'administration par la voie digestive a été analysée de façon à proposer une voie d'administration du vaccin susceptible de diminuer les effets secondaires locaux et d'éviter les risques d'infections dues à l'injection comme la transmission de virus (VIH-SIDA, hépatite). La caractérisation des molécules immunodominantes, reconnues par le système immunitaire lors d'une vaccination, a été un thème majeur de recherche.

La vaccination par le BCG induit des réponses immunitaires protectrices par voie orale ou rectale (Micheline Lagranderie, Mohammad Abolhassani, Pierre Chavarot, Gilles Marchal)

L'administration du BCG par voie orale a été utilisée initialement par Calmette en 1921. Cette voie a été abandonnée du fait d'effets secondaires tels que le développement d'adénopathies cervicales importantes. La translocation, passage du BCG dans l'aire oropharyngée, n'est pas indispensable pour induire une immunité protectrice vis-à-vis d'une épreuve infectieuse par M. tuberculosis. La voie rectale a aussi été explorée. Cette méthode de vaccination serait facile à mettre en œuvre, peu dispendieuse et sûre. Les essais conduits chez trois espèces animales (souris, cobayes et macaques) montrent que les réponses immunitaires spécifiques sont similaires à celles observées après injection par voie sous-cutanée ou intradermique. Des niveaux de protection identiques ont été obtenus vis-à-vis d'une épreuve infectieuse avec une souche virulente au moins 6 mois après l'immunisation d'adultes ou de souriceaux nouveau-nés.

La présence de résidus mannose sur la molécule Apa est indispensable pour l'expression de l'antigénicité de cette molécule (Félix Romain, Pascale Pescher, Gilles Marchal)

Les molécules sécrétées de 45/47 kDa (Apa), présentes dans les filtrats de culture de BCG, M. tuberculosis ou M. bovis, ont été identifiées et purifiées sur leur capacité à interagir essentiellement avec les lymphocytes T ou les anticorps induits par l'immunisation avec des bactéries vivantes. Ces molécules sont glycosylées. Une élimination des résidus de mannose par voie chimique ou enzymatique a été effectuée. Ces molécules déglycosylées sont 30 à 100 fois moins actives que les molécules natives pour initier les réactions d'hypersensibilité de type retardé chez les cobayes immunisés par le BCG vivant ou pour stimuler in vitro les lymphocytes T spécifiques.

Les molécules Apa recombinantes produites dans M. smegmatis sont 4 à 10 fois moins efficaces que les molécules natives, en relation avec le type de glycosylation. Les molécules recombinantes produites dans E. coli sont quasiment inactives, en relation avec l'absence de glycosylation. Le rôle des résidus de mannose dans la constitution même de l'épitope reconnu par les lymphocytes T spécifiques est actuellement en cours d'étude, en particulier grâce à la synthèse de glycopeptides identiques aux peptides natifs.

Rôle de la superoxyde dismutase à zinc ou cuivre de M. tuberculosis (Olivier Dussurget, Pascale Pescher, Gilles Marchal)

Les superoxyde dismutases jouent un rôle déterminant dans la protection contre les dérivés actifs de l'oxygène. Les enzymes ont été rapportés comme étant des facteurs de pathogénicité chez de nombreuses espèces bactériennes. Ont été préparées des souches mutantes de M. tuberculosis et de BCG où le gène codant la superoxyde dismutase Zn/Cu est inactivé. De telles souches de bactéries montrent in vitro une susceptibilité légèrement accrue aux dérivés de l'oxygène. Par contre ces souches gardent la même virulence lors des infections expérimentales. La superoxyde dismutase Zn/Cu ne paraît pas jouer de rôle essentiel pour la pathogénicité de ces bactéries.

Utilisation des molécules 45/47 kDa (Apa) pour le diagnostic de tuberculose active (Cynthia Horn, Gilles Marchal)

Exploration de l'immunité cellulaire : Des molécules 45/47 kDa (Apa) natives ont été utilisées pour stimuler in vitro des lymphocytes du sang provenant de malades atteints de tuberculose ou de sujets témoins sensibilisés, réactifs à la tuberculine. Alors que les lymphocytes de ces deux groupes de personnes sont stimulés de façon identiques par une PPD (tuberculine), seuls les lymphocytes des malades sont stimulés par les molécules 45/47 kDa (Apa).

Mise en évidence d'antigènes :Afin de développer une méthode de diagnostic rapide de la tuberculose, des anticorps monoclonaux dirigés contre les molécules de 45/47 kDa (Apa) et les molécules elles-mêmes ont été utilisés par Vohangy Rosolofo et Suzanne Chanteau à l'Institut Pasteur de Madagascar. Les premiers résultats montrent qu'il est possible de mettre évidence des antigènes spécifiques de M. tuberculosis dans des produits biologiques très pauvres en bacilles (liquide céphalo-rachidien, liquide pleural..) souvent négatifs en culture.

Mots-clés: Tuberculose, Epidémiologie, Typage moléculaire, Antigène immunodominant, Mannosylation, Mycobactéries de l’environnement



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Laurence Hay (1/2 temps)

Martine Mercier (1/2 temps)

Gilles Marchal, Institut Pasteur, Professeur, gmarchal@pasteur.fr

Véronique Vincent, Institut Pasteur, Chef de Laboratoire, vvincent@pasteur .fr

Maria-Cristina Gutierrez Perez, Institut Pasteur, Chargée de recherches, crisgupe@pasteur .fr

Stéphane Flamant

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Helmi Merdassi

Samiya Al Zadjali

Mabrouka Saidani

Malika ifticene

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Fatma Galem

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Mohammad Abolhassani

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Stéphane Flamant

Abdelmajid Snouber

Helmi Merdassi

Samiya Al Zadjali

Mabrouka Saidani

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