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Version PDF      Chimie Structurale des Macromolécules


  Responsable : BÂRZU Octavian (obarzu@pasteur.fr)


  resume

 

Notre activité de recherche est centrée sur les kinases d'organismes pathogènes ayant comme substrat les nucléotides ou les sucres et qui représentent des cibles potentielles en thérapie antibactérienne. Deux enzymes provenant de Mycobacterium tuberculosis et Streptococcus pneumoniae ont été plus particulièrement étudiés cette année. Plusieurs gènes de M. tuberculosis codant des protéines de fonction inconnue ont été choisis en vue de cristallisation et analyse structurale.



  rapport

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1. Nucléoside monophosphate (NMP) kinases de M. tuberculosis(H. Munier-Lehmann, en collaboration avec G. Labesse, D. Douguet, L. Dugué, O. Dutruel, S. Pochet, P. Herdewijn, S. Van Callenbergh, A. Haouz, P. Alzari)

Les NMP kinases ont été choisies comme cibles pour la recherche de nouveaux antibiotiques, plus particulièrement pour Mycobacterium tuberculosis, bactérie responsable de la tuberculose. Pour ce faire, une approche par conception à partir de la structure tridimensionnelle a été retenue. Deux NMP kinases, la TMP kinase et l'UMP kinase, ont été plus particulièrement étudiées et ce projet est l'objet d'un Programme Transversal de Recherche regroupant plusieurs équipes de l'Institut Pasteur. Pour la TMP kinase de M. tuberculosis, la recherche d'analogues du substrat (analogues nucléosidiques du dTMP) a été poursuivie. De plus, des molécules non nucléosidiques ont été sélectionnées par criblage in silico de banques de molécules ou par optimisation rationnelle du substrat naturel. D'autre part, des analogues de type bisubstrat sont en cours d'études. Pour les meilleurs d'entre eux (Ki de l'ordre du m M ou en deçà), des essais de co-cristallisation avec la TMP kinase de M. tuberculosis seront entrepris.

Pour l'UMP kinase, des cristaux diffractant à environ 3,5 Å ont été obtenus cette année. Les conditions de cristallogénèse sont en cours d'optimisation car à cette résolution la structure fine du site actif n'est pas accessible.

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2. UMP kinases d'Hemophilus influenzae et de Streptococcus pneumoniae(A.-M. Gilles, L. Assairi, C. Evrin, P. Christova, M. Ionescu, I.O. Sirbu, N. Slavova-Azmanova, en collaboration avec N. Bucurenci, G. Labesse et C.T. Craescu)

Les UMP kinases bactériennes sont différentes de leurs homologues eucaryotes tant du point de vue séquence que structural. Un modèle structural de l'UMP kinase d'E. coli et de B. subtilis, basé sur la conservation du repliement de la carbamate kinase, a été construit en collaboration avec G. Labesse . Nous avons poursuivi la caractérisation structurale de l'enzyme de deux organismes pathogènes : Haemophilus influenzae et Streptococccus pneumoniae. Des études spectroscopiques utilisant des analogues nucléotidiques fluorescents (3'-Ant-dGTP, 3'-Ant-dUTP et 3'-Ant-dADP) menées en parallèle sur l'enzyme sauvage et sur des variants obtenus par mutagenèse dirigée, suggèrent que les sites allostériques pour l'UTP (inhibiteur) et GTP (activateur) sont largement chevauchants voire même identiques. Une étude menée par isocalorimétrie confirme la thèse d'un site commun pour l'UTP et le GTP.

3. Opéron deoK(A.-M. Gilles, L. Assairi en collaboration avec C.T. Craescu, T. Bertrand, P. Briozzo, C. Le bouguenec et J. Neuhard)

Salmonella enterica, contrairement à E. coli K12, est capable d'utiliser le désoxyribose (dR) comme source unique de carbone et d'énergie, propriété due à la présence chez cet organisme d'une désoxyribokinase (DeoK). Le gène deoK ainsi que deux autres gènes, deoP et deoX constitue l'opéron deoKPX régulé par un répresseur, DeoQ. En collaboration avec J. Neuhard, nous avons montré que deoQ et l'opéron deoKPX sont transcrits par deux promoteurs différents situés dans la région intercistronique deoQ et deoK, que le promoteur de l'opéron deoKPX est 10 fois plus fort que celui de deoQ et que l'expression de l'opéron deoKPX est contrôlée par la répression catabolique.

Nous avons aussi mis en évidence la présence de l'opéron deoK chez Citrobacter freundii, Yersinia enterolytica, Agrobacterium tumefaciens, Rhobacter sphéroïdes et dans des souches pathogènes d'E. coli. La distribution de cet opéron parmi les souches pathogènes mais aussi commensales d'E. coli a été entreprise en collaboration avec C. Le bouguenec dans le cadre du PTR53. La capacité d'utiliser le dR apparaît significativement associée aux souches responsables de pyélonéphrites et de scepticémie. Curieusement, 15% des souches commensales possèdent l'opéron deoK.

Nos efforts ont aussi porté sur la recherche de la fonction de la protéine DeoX dont la présence est nécessaire pour une croissance optimale des bactéries en présence de dR. La comparaison des séquences de DeoX avec d'autres protéines impliquées dans le métabolisme des sucres nous a suggéré que DeoX est une mutarotase. En effet, cette protéine que nous appellerons désormais DeoM accélère l'interconversion des anomères a et b du désoxyribose. Par mutagenèse dirigée, nous avons identifié plusieurs résidus impliqués dans le processus catalytique.

4. NAD kinase de Bacillus subtilis(L. Assairi en collaboration avec G. Labesse et D. Douguet)

La mutagénèse dirigée de plusieurs résidus de la NAD kinase conservés dans la 6-phosphofructokinase d'E. coli a montré que le motif GGDGT est impliqué dans la reconnaissance de l'ATP. Les formes modifiées de NAD kinase de B. subtilis (G44A, D45A, et G46A) sont pratiquement inactives. La forme T47A a une spécificité de substrat plus restreinte, ne pouvant plus utiliser le CTP et l'UTP comme donneur de phosphate. Un autre acide aminé identifié comme important pour la catalyse dans la NAD kinase est le Phe74. Des essais de cristallisation de l'enzyme seront entrepris.

5. Génomique structurale à l'Institut Pasteur(L. Assairi, H. Munier-Lehmann et E. Seclaman)

Notre laboratoire participe au projet de génomique structurale des mycobactéries. Nous avons réalisé le clonage de quinze gènes de M. tuberculosis, codant des protéines de fonction inconnue et n'ayant aucune similitude avec des protéines autres que d'origine mycobacterienne ou d'actinomycète. La majorité des protéines recombinantes exprimées chez E. coli sont insolubles et des mises au point de conditions de cultures et de tampons pour la solubilisation sont en cours d'étude. Cependant, l'une de ces protéines s'est avérée soluble et stable et en collaboration avec l'Unité de Biochimie Structurale est actuellement soumise à des essais de cristallogénèse.

Mots-clés: kinases, organismes pathogènes, opéron deo, conception d’inhibiteurs, génomique structurale



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Lambrecht, Marie-Régine,lambrech@pasteur.fr BÂRZU Octavian, CNRS, Directeur de Recherche 1,obarzu@pasteur.fr

GILLES Anne-Marie, Institut Pasteur, Chef de Laboratoire,amgilles@pasteur.fr

MUNIER-LEHMANN Hélène, INSERM, Chargée de Recherche 1,hmunier@pasteur.fr

ASSAIRI Liliane, CNRS, Chargée de Recherche 1.

CHRISTOVA Petya, Chercheur.

EVRIN Cécile, Etudiant DEA.

LEON Ruth, Doctorante.

SECLAMAN Edward, Chercheur.

SIRBU Ioan, Ovidiu, Chercheur, Docteur en Médecine.

SLAVOVA-ASMANOVA Neli, Chercheur, Docteur en Médecine

Lambrecht Marie-Régine, Secrétaire,lambrech@pasteur.fr

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