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Version PDF      Immuno-Hématologie et d'Immunopathologie


  Responsable : Guillaume DIGHIERO (dighiero@pasteur.fr)


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Dans la LLC, les travaux de l'Unité ont été consacrés à : 1) l'étude des mécanismes à l'origine de la sous-expression du récepteur B ; 2) l'étude de l'expression de l'AID (activation induced cytidine deaminase) ; 3) l'étude des profils d'expression génique par la technique des puces à ADN et 4) l'étude " in vitro " de la faisabilité d'une vaccination anti-idiotypique à l'aide de cellules dendritiques.



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IMMUNOPATHOLOGIE DE LA LEUCEMIE LYMPHOIDE CHRONIQUE (LLC)

Introduction

La leucémie lymphoïde chronique B (LLC-B) est la forme la plus fréquente de leucémie dans les pays occidentaux. Elle est considérée comme une maladie correspondant à l'accumulation lente et progressive de lymphocytes B petits et matures ayant une origine clonale commune et dont la survie est prolongée par un défaut d'apoptose. Les cellules B de LLC présentent un phénotype caractéristique défini par l'expression de faibles taux du récepteur pour l'antigène (BCR) et l'expression constante de CD5 et CD23.

La LLC est une maladie tumorale avec une évolution relativement lente, puisque la médiane de survie dépasse 7 ans. Certains patients ont une espérance de vie qui n'est pas modifiée par l'existence de l'hémopathie, ne sont pas traités et meurent de pathologies non associées. D'autres vont mourir dans des délais variables de complications liées à la maladie. Il est donc fondamental de disposer dès le diagnostic de critères qui permettent d'évaluer le risque individuel de progression afin de pouvoir proposer une stratégie thérapeutique. A part les classifications pronostiques dont celle de Binet, la plus utilisée en Europe, plusieurs facteurs biologiques présentent un intérêt pronostique dont principalement le profil de mutation des gènes pour les Ig. Dans les LLCs de bon pronostic, les cellules expriment des gènes mutés codant pour les Igs, alors que dans les LLCs de mauvais pronostic, la transformation surviendrait dans une cellule B naïve, ne présentant pas de mutation au niveau des gènes des Igs.

Si la chimiothérapie conventionnelle est en mesure d'induire fréquemment une régression importante de la masse tumorale la rechute est inéluctable et cette maladie demeure incurable. Parmi les traitements complémentaires, l'immunothérapie avec des anticorps monoclonaux ou des vaccins utilisant l'idiotype sont activement étudiés.

1) Mécanismes à l'origine de la faible expression du récepteur pour l'antigène (BCR) dans la LLC (Responsable : B. Payelle-Brogard en collaboration avec C. Magnac et F. Vuillier).

Contrairement aux autres hémopathies malignes du lymphocyte B mature, le clone tumoral de la LLC, exprime d'une façon caractéristique des faibles taux du BCR, qui est composé de l'immunoglobuline de membrane (Igm) complexée de façon non covalente avec deux hétérodimères CD79a/CD79b. Ceci se traduit par une anomalie dans la transduction de signal, définie par une réponse proliférative défectueuse, une phosphorylation des tyrosines et une mobilisation calcique anormales, lors de l'activation du BCR. Toutefois, les mécanismes à l'origine de cette sous-expression demeurent inconnus.  

Nos résultats nous ont permis d'écarter l'existence d'un problème génétique, ainsi que d'un problème au niveau de la transcription. Dans le cas du gène codant pour la molécule CD79b, l'ADN génomique ne présente pas d'anomalies structurales mais lors de la transcription il pourrait y avoir une présence, en quantité anormale, de transcrits courts provenant d'un épissage alternatif et ne possédant pas le domaine extra-cellulaire, qui entraînerait une diminution d'expression du récepteur B ainsi qu'une altération de la transduction des signaux d'activation. Nos résultats ont montré que la sous-expression du BCR dans la LLC n'était pas imputée à des altérations génétiques ou transcriptionnelles.

Par contre, une anomalie post-transcriptionnelle, à savoir un défaut d'assemblage des différentes chaînes du BCR, a pu être montrée par marquage intra-cytoplasmique. D'autre part, par des expériences de pulse-chase nous avons mis en évidence un défaut de transport du récepteur du réticulum endoplasmique (RE) vers le Golgi.   Ainsi, la sous-expression du BCR dans les lymphocytes de LLC apparaît liée à une anomalie dans l'assemblage et le transport intracellulaire comme cela avait été rapporté dans un modèle de cellules B anergiques chez la souris. En utilisant la microscopie confocale, nous avons confirmé le blocage au niveau du RE, à travers des doubles marquages incluant les différentes molécules du BCR et la calnexine. Les figures ci-dessous montrent qu'une co-colisation des molécules µ et CD79b existe dans les cellules de la lignée B Daudi, au contraire cette co-localisation n'est pas observée dans les cellules de LLC.

2) Etude de l'expression de l'AID dans la LLC (Responsables : G. Dighiero avec P. Oppezzo et G. Dumas).

Des travaux récents ont montré que l'AID joue un rôle clé dans les processus de mutation somatique (MS) et commutation isotypique (CI) du lymphocyte B normal puisque: 1) des lignées murines dépourvues de cette enzyme et des malades exprimant des mutations somatiques au niveau du site actif de cette enzyme qui la rendent incompétente, se sont avérées incapables d'induire des MS et de procéder à la CI; 2) des lignées plasmocytaires obtenues à partir de souris dépourvues de l'AID s'avèrent aussi incapables de MS et CI, mais deviennent compétentes lorsque le gène de l'AID leur est transfecté; 3) l'induction du processus de CI est associée à l'induction de mutations dans la région dite de "pre-switch µ" et 4) l'AID est capable d'induire des mutations somatiques au niveau de l'ADN de Escherichia Coli.

Le mécanisme par lequel l'AID induit la MS et la CI n'est pas élucidé à ce jour. L'AID est structurellement proche de l'APOBEC, qui est la première "RNA editing enzyme" décrite chez les mammifères ce qui a conduit à proposer qu'elle pourrait agir en modifiant au niveau de l'ARN différents substrats de nucléases encore inconnues et qui joueraient un rôle essentiel dans la MS et la CI. Toutefois, des résultats récents montrent que l'AID pourrait agir directement au niveau de l'ADN par un mécanisme de déamination.

Comme dans un travail antérieur, nous avons pu démontrer que dans la LLC on observait fréquemment l'expression simultanée dans la même cellule de transcrits mu, delta et gamma exprimant le domaine variable du clone tumoral, nous avons décidé d'étudier l'expression de l'AID dans des cellules de LLC, comparativement avec celle de lymphocytes B normaux après stimulation par la voie CD40L (l'AID n'est pas exprimée constitutivement dans le lymphocyte normal). Nos résultats ont montré que les LLC qui expriment constitutivement l'enzyme (environ 20% des cas), ont un processus de CI actif caractérisé par l'expression simultanée dans la même cellule de transcrits mu, delta, gamma et parfois alpha. Ces cellules présentent au niveau de l'ADN de nombreuses mutations dans la région " pre-switch m  ". Toutefois, malgré une expression constitutive importante de l'AID, elles ne présentent pas de MS au niveau du domaine VDJ des gènes de l'immunoglobuline. Pour mieux définir ce processus, nous avons stimulé par la voie CD40 ligand des lymphocytes B de LLC exprimant constitutivement l'AID et ceux de LLC ne l'exprimant pas, ainsi que des lymphocytes B normaux. Nous avons obtenu une surexpression chez les malades l'exprimant constitutivement et une expression constante dans des lymphocytes B des malades ne l'exprimant pas constitutivement ainsi que dans les lymphocytes B normaux. L'expression de l'AID était associée à l'induction d'une CI et de mutations somatiques au niveau de la région " pre-switch  µ ". Cependant nous n'avons pu mettre en évidence de mutations somatiques au niveau du domaine VDJ. Ces résultats favorisent l'idée que le processus de mutation somatique requiert la présence de facteurs autres associés à l'AID.

3) Etude de l'expression génique dans la LLC (Responsables : G. Dighiero avec Yuri Vasconcelos en collaboration avec Frédéric Davi (Hôpital Pitié-Salpêtrière), Florence Cymbalista (Hôtel-Dieu de Paris) et Xavier Troussard (CHU de Caen).

Le Groupe Coopératif Français pour l'étude de la LLC (GCF-LLC), auquel participent depuis plus de 25 ans plus de 40 centres en France, a mis en place trois grandes études thérapeutiques à long terme dans la LLC incluant plus de 3300 malades (>60 % du total des malades de la littérature inclus dans des essais randomisés). Les résultats de ces études ont permis des avancées considérables dans le traitement de la maladie. De plus, une importante sérothèque et cellulothèque de ces malades est disponible et les données cliniques et biologiques sont enregistrées dans une base de données.

Suite à l'appel d'offres CIT2 pour l'étude de l'expression génique dans les cancers, notre groupe a présenté un projet d'étude de la LLC qui a été retenu. Dans le projet CIT2, que j'ai présenté au nom du groupe Français pour l'étude de la LLC, dont je suis le président, nous nous sommes proposé de comparer le profil d'expression génique des LLC exprimant des gènes d'Ig sans mutations somatiques à celui des LLC exprimant des gènes Ig avec mutations somatiques au niveau des gènes d'Ig. Le pronostic très différent, associé à la présence ou pas de mutations somatiques a conduit à se poser la question de l'existence d'une même maladie ou de deux maladies différentes. Pour obtenir une réponse rapide à cette question, nous avons décidé d'utiliser les puces Affymetrix, disponibles dans le cadre des appels d'offre du Ministère de la Recherche.

Nous avons entrepris d'étudier 18 malades (9 présentant des formes très stables de la maladie et exprimant des gènes d'Ig mutés et 9 formes agressives exprimant des gènes Ig non mutés). Nos résultats montrent que ces deux formes à pronostic très différent ont des profils d'expression génique différents. Une analyse supervisée a montré une expression différentielle de 85 gènes qui étaient surexprimés soit par les formes mutées soit par les formes non mutées. Fait important, une analyse non supervisée a permis de séparer pour la première fois les formes mutées et stables des formes non-mutées et aggressives. Ces résultats ont été confirmés en employant des techniques de RT-PCR quantitative.

4) Etude  in vitro de la faisabilité d'une vaccination anti-idiotypique à l'aide de cellules dendritiques dans la LLC (Responsable : F. Vuillier).

De nombreuses études in vitro et in vivo menées chez l'animal et chez l'homme ont montré que l'idiotype peut engendrer une réponse humorale et/ou cellulaire anti-tumorales dans les cas de lymphomes ou de myélomes. Toutefois, l'induction d'effecteurs T cytotoxiques et plus particulièrement T CD8 anti-idiotypiques dirigés contre le clone tumoral demeure difficile à démontrer. Notre laboratoire a été chargé par le (GCF-LLC), d'étudier la fonctionnalité des cellules dendritiques des patients atteints de LLC, et d'évaluer leur capacité à induire une immunité cellulaire contre le clone tumoral à la suite de leur sensibilisation par l'idiotype.

Dans un premier temps, une étude de la fonctionnalité des cellules dendritiques dans la LLC a été entreprise. Ainsi, des monocytes isolés de patients atteints de LLC et de sujets normaux ont été induits à se différencier en cellules dendritiques en présence de GM-CSF et d'IL-4. Elles ont ensuite été étudiées pour leurs caractéristiques morphologiques, phénotypiques et fonctionnelles. Ces études ont montré que des cellules dendritiques fonctionnelles pouvaient être générées à partir des monocytes circulants de LLC. Dans un deuxième temps, nous avons isolé et cloné les gènes VH et VL de l'immunoglobuline tumorale de différents malades. Ce travail nous a permis de produire in vitro l'idiotype tumoral sous différentes formes pour chacun de ces patients, soit sous forme d'immunoglobuline complète après transfection des gènes dans un vecteur d'expression et production dans une lignée eukaryote, soit sous forme de peptide correspondant à la région hypervariable de la chaîne lourde (CDR3), soit sous forme de peptide à forte affinité pour les molécules de classe I. Les cellules dendritiques générées à partir des monocytes circulants ont été sensibilisées par l'idiotype tumoral sous les différentes formes précédemment décrites. Ensuite, les cellules dendritiques immatures ou matures après stimulation par CD40 ligand trimérique ont été évaluées pour leurs capacités à induire des cellules CD4 et CD8 spécifiques du clone tumoral.

Dans ces conditions de culture particulières nous avons réussi à induire dans la majorité des cas des lignées CD8 produisant toutes de l'interféron gamma en présence des cellules tumorales et exprimant une faible activité cytotoxique anti-tumorale. Cette démarche, in vitro, a permis de définir des bases rationnelles à l'utilisation d'une vaccination avec des cellules dendritiques sensibilisées par l'idiotype tumoral et a servi comme support à un protocole "in vivo" du GCF-LLC utilisant les cellules dendritiques du patient stimulées par le lysat de la cellule tumorale. Ce protocole vient de recevoir l'aval de l'AFSSAPS.

ETUDE DE LA RESTAURATION IMMUNITAIRE VIS-A-VIS DE DEUX PATHOGENES : CMV ET T.GONDII (Responsable : D. Scott-Algara, M. Alfonzo, M. Bedora).

Nous avons mené une étude prospective concernant la restauration immunitaire concernant deux pathogènes chez les patients en phase chronique infectés par le VIH-1 après le début d'une thérapie multiple antirétrovirale. Nous avons pu montrer que les souris SCID humanisées avec des cellules lymphoïdes de sujets infectés par le VIH-1 après le début de la thérapie et infectées avec T.gondii ont une survie plus longue que les souris témoins ; les patients non traités avaient une activité cytotoxique contre le CMV malgré l'absence de prolifération spécifique contre les Ag CMV et d'une sécrétion d'INF-g et d'IL-2 ; la reconstitution de réponses spécifiques anti-CMV a été observée après 6 mois de thérapie antirétrovirale ; cependant une sécrétion d'IL-2 n'a jamais été remarquée pendant le suivi. En conclusion, la restauration immunitaire partielle de l'immunité est observée durant la thérapie antirétrovirale.

Mots-clés: Autoimmunité, Leucémie Lymphoïde Chronique, Immunopathologie



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  BOUYSSIE Reine,bouyssie@pasteur.fr BROGARD Béatrice, Chargée de Recherche CNRS,bbrogard@pasteur.fr

SCOTT-ALGARA Daniel, Chargé de Recherche IP,scott@pasteur.fr

ALFONZO DIAZ Miguel

GIORDANO Mirta

OPPEZZO Pablo,popezzzo@pasteur.fr

TISCORNIA Adriana

VASCONCELOS Yuri,yvasconc@pasteur.fr

BEDORA Marie, Technicienne Supérieure IP,mbedora@pasteur.fr

DUMAS Gérard, Technicien Supérieur IP,dumas@pasteur.fr

MAGNAC Christian, Ingénieur IP,magnac@pasteur.fr

VUILLIER Françoise, Ingénieur IP,vuillier@pasteur.fr



Laboratoire de préparation :

LAURENT Nathalie


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