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Version PDF      Intéractions Bactéries- Cellules


  Responsable : Cossart Pascale (pcossart@pasteur.fr)


  resume

 

Notre Unité étudie les bases moléculaires et cellulaires du pouvoir pathogène de Listeria monocytogenes, une bactérie responsable d'infections alimentaires graves, devenue un système modèle pour comprendre le parasitisme intracellulaire en général et à l'échelle moléculaire l'exploitation des fonctions cellulaires par les pathogènes. L. monocytogenes est responsable de gastro-entérites, de septicémies, de méningites et d'avortements chez l'homme et certains animaux. La mortalité s'élève à 30 %. Les sujets à risque sont les femmes enceintes et les enfants à naître, les nouveaux nés et les personnes âgées, ainsi que les sujets immunodéprimés. L. monocytogenes a la capacité de traverser la barrière intestinale puis les barrières hémato-encéphalique et fœto-placentaire. Dans tous les tissus qu'elle infecte, Listeria est intracellulaire. In vitro, L. monocytogenes entre dans de nombreux types cellulaires et s'y multiplie. Après lyse de la vacuole de phagocytose, les bactéries se répliquent, se déplacent dans le cytosol et passent de cellule en cellule en utilisant un mode de propulsion original : la polymérisation de l'actine cellulaire à l'un des pôles bactériens. En 2002, notre activité a porté sur l'étude des différents composants bactériens et cellulaires contrôlant l'entrée des bactéries dans les cellules, sur l'analyse des vacuoles de phagocytose, sur la régulation de l'expression des gènes de virulence et sur l'identification de nouveaux gènes de virulence. Nous avons aussi poursuivi l'étude de la motilité actine-dépendante de Rickettsia conorii, une autre bactérie intracellulaire et entrepris d'analyser comment cette bactérie entre dans les cellules.



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I. Entrée de L. monocytogenes dans les cellules de mammifères

L'étude de l'internaline (ou InlA) et InlB, deux protéines bactériennes impliquées dans l'entrée dans les cellules a été poursuivie.

L'internaline et son récepteur la E-cadhérine, un couple critique pour la traversée de la barrière intestinale (E. Huillet, M. Lecuit, S. Sousa)

Le récepteur de l'internaline est la E-cadhérine. L'internaline interagit avec la E-cadhérine humaine, de poulet ou de cobaye mais pas avec la E-cadhérine murine ou celle de rat. Ces résultats expliquent pourquoi l'internaline ne joue aucun rôle dans le modèle d'infection murin. L'analyse du rôle de l'internaline chez le cobaye ainsi que chez des souris transgéniques exprimant la E-cadherine humaine au niveau de l'intestin ( en collaboration avec C. Babinet , Unité de Biologie du développement, Institut Pasteur) a permis de démontrer le rôle critique de l'internaline dans la traversée de la barrière intestinale par L. monocytogenes. Il s'agit du premier modèle transgénique d'une infection humaine ayant permis l'identification du rôle précis d'un facteur de virulence bactérien. Pour analyser le rôle éventuel de l'internaline dans la traversée des barrières hémato-encéphalique et fœto-placentaire, nous avons entrepris de générer d'autres souris transgéniques exprimant la E-cadhérine humaine en lieu et place de la cadhérine murine.

Nous avons analysé le rôle du domaine cytoplasmique de la E-cadhérine dans l'entrée : la E-cadhérine doit être connectée au cytosquelette d'actine par les caténines pour permettre l'entrée. Nous tentons d'identifier toutes les protéines cellulaires impliquées dans la polymérisation d'actine et le remodelage de la membrane plasmique au site d'entrée. Nous venons de démontrer l'implication d'une myosine non conventionnelle la myosine VIIA qui est normalement recrutée aux jonctions adhérentes par l'alpha-caténine et par une molécule adaptarice transmembranaire, la vézatine. C'est la première fois qu'une myosine non conventionnelle est impliquée dans l'entrée d'une bactérie pathogène dans les cellules épithéliales.

La protéine InlB et ses récepteurs gC1q-R et Met(H. Bierne, S. Dramsi, N. Khelef)

InlB est associée d'e façon labile à la surface de la bactérie. L'un des récepteurs d'InlB est le gC1q-R, le récepteur de la forme globulaire du C1q, le premier composant de la cascade du complément. Cette protéine n'a pas de domaine transmembranaire ni de domaine cytoplasmique, ce qui laissait supposer l'existence d'un co-récepteur afin qu'un relais avec le cytosol puisse avoir lieu. Un autre récepteur d'InlB et un possible co-récepteur de gC1qR est Met, le récepteur de l'HGF ou " scatter factor ", qui appartient à la famille des récepteurs aux facteurs de croissance à activité tyrosine kinase. Ce récepteur interagit avec la région N-terminale d'InlB, la partie LRRs. Nous avons montré que la partie C-terminale d'InlB peut interagir directement avec les cellules, par le biais des glycosaminoglycanes. Elles interagissent aussi avec le gC1qR. Nous étudions les rôles respectifs de Met et de gC1q-R au cours de l'entrée, l'interaction éventuelle entre ces deux récepteurs et les évènements qui ont lieu après l'entrée. Nous avons aussi entrepris l'étude de la synergie potentielle entre l'internaline et InlB au cours de l'entrée.

La signalisation et les réarrangements du cytosquelette lors de l'entrée InlB(H. Bierne, S. Dramsi, N. Khelef)

Nous avons montré que la protéine InlB purifiée active la PI 3-kinase en stimulant la phosphorylation de trois protéines adaptatrices, Gab1, Cbl et Shc. InlB est le premier agoniste bactérien de la PI 3-kinase. Alors que les bactéries entrent dans les cellules sans produire d'importants réarrangements du cytosquelette d'actine, InlB soluble produit des replis membranaires et une polymérisation spectaculaire de l'actine. Nous analysons les mécanismes permettant ces réarrangements, et avons mis en évidence les rôles du complexe Arp 2/3, du couple cofiline-LIM-kinase et ceux des GTPases de la famille Rho, qui sont impliquées dans la régulation de la polymérisation de l'actine. Nous recherchons aussi les cibles des produits de la PI 3-kinase. En aval de l'activation par InlB de l'activité PI-3 kinase, la PLC-gamma est stimulée, induisant la production d'IP3 et la libération des stocks de calcium intracellulaire. Cependant, la PLC-gamma n'a pas de rôle direct au cours de l'entrée et pourrait intervenir au cours d'évènements plus tardifs. InlB est aussi capable d'activer NF-kB. L'activation de NF-kB passe par Ras et Akt. Les conséquences de l'activation de ces voies de signalisation sont en cours d'analyse. Comme tous ces résultats l'illustrent, InlB est une protéine bactérienne ayant une activité de signalisation assez exceptionnelle.

Autres facteurs contrôlant l'entrée (S. Dramsi, S. Seveau):

Nous venons de démontrer que l'hémolysine de Listeria, la listériolysine O qui jusqu'ici était connue pour jouer essentiellement un rôle dans l'échappement de la vacuole de phagocytose joue aussi un rôle clé dans l'entrée de calcium extracelllulaire dans les cellules, un événement important pour l'entrée dans les cellules non phagocytaires. Nous analysons par ailleurs la dynamique de la réorganisation de la membrane plasmique au cours de l'entrée .

II. Identification des molécules spécifiques des phagosomes contenant L. monocytogenes(J. Pizarro-Cerda)

Afin d'identifier les molécules clés pour l'internalisation de L. monocytogenes dans les cellules ainsi que pour la maturation de la vacuole d'internalisation, nous avons entrepris d'analyser la composition moléculaire des vacuoles d'internalisation de Listeria. Les vacuoles sont isolées par fractionnement subcellulaire après interaction des cellules avec des billes de latex recouvertes d'InlA ou InlB. La composition protéique de ces phagosomes est analysée par spectrométrie de masse. Par cette approche, nous avons mis en évidence l'association d'une septine la septine 9 ou MSF avec les phagosomes contenant les billes de latex recouvertes d'InlB. MSF est une GTPase capable de former de filaments qui colocalisent avec le cytosquelette d'actine. Nous étudions le rôle du domaine GTPase dans l'entrée de Listeria dans les cellules cibles. Nous avons également identifié la présence d'une PI 4-kinase associée préférentiellement aux phagosomes contenant les billes recouvertes d'InlB dont le rôle dans le processus d'internalisation de Listeria est en cours d'analyse.

III. Régulation de l'expression des gènes de virulence de L. monocytogenes

Mise en évidence d'un thermosenseur(J. Johansson, P. Mandin)

La protéine PrfA est un activateur pléiotrope de la transcription de la majorité des gènes de virulence de L. monocytogenes. La régulation de l'expression de cette protéine est complexe. L'expression de la protéine est augmentée en présence des cellules hôtes ou d'extraits cellulaires mais les signaux responsables de cette activation ne sont pas connus. Dans certaines conditions environnementales où les gènes de virulence sont réprimés, la protéine peut être présente mais inactive mais les bases moléculaires de ce contrôle sont elles aussi inconnues. L'expression de PrfA est élévée à haute temperature et inhibée à basse température. Nous venons de mettre en évidence une régulation d'un type tout à fait nouveau. En effet à basse température (20°C) , la partie 5' de l'ARN messager codant PrfA peut former une tige et boucle qui séquestre la séquence Shine et Dalgarno et empêche la traduction du transcrit. A haute température, cette structure ne se forme plus et la traduction a lieu et par voie de conséquence, les gènes de virulence exprimés.

Analyse transcriptomique du régulon PrfA (E. Milohanic en collaboration avec C. Buchrieser, P. Glaser et la Génopole)

La séquence du génome a permis de générer des membranes portant l'ensemble des gènes de Listeria. Nous avons analysé l'expression de tout le génome dans une souche sauvage et dans une souche délétée pour le gène prfA, dans différents milieux. Cette étude a révélé qu'en dehors des 10 gènes régulés par PrfA déjà connus, Listeria possède deux autres gènes directement activés par PrfA, huit gènes régulés négativement et cinquante trois gènes qui sont sous le contrôle indirect de PrfA. Les deux gènes activés directement par PrfA sont en cours d'analyse.

IV. Identification de nouveaux gènes de virulence par mutagénèse aléatoire (D. Cabanes, S. Dramsi, J. Johansson, P. Mandin)

Pour identifier de nouveaux gènes de L. monocytogenes indispensables au processus infectieux in vivo dans le modèle expérimental murin, nous avions utilisé une approche génétique appelée STM ou "Signature-tagged mutagenesis'. La fonction de deux gènes ainsi identifiés est actuellement en cours d'analyse. Il s'agit de gènes codant la proteine FbpA et un système à deux composants VirR/VirS. FbpA est une protéine de surface qui n'a cependant pas de séquence signal suggérant un mécanisme nouveau d'adressage à la surface. Elle fixe la fibronectine et permet l'adhésion de la bactérie à la cellule. Notre hypothèse actuelle est que cette protéine aurait un rôle dans l'interaction avec la matrice extracellulaire. Le système VirR/VirS est analysé par une approche transcriptomique. Il régule une série de gènes qui sont en cours d'étude. Les signaux contrôlant l'expression de ce régulon sont aussi recherchés.

V. Approche post-génomique de l'étude de la virulence de Listeria(C. Archambaud, H. Bierne, D. Cabanes, O. Dussurget, P. Dehoux, E. Milohanic)

En collaboration avec le Laboratoire de Génomique des Pathogènes (P. Glaser, F. Kunst, C. Buchrieser et L. Frangeul) et un consortium européen, nous avons séquencé, annoté et comparé les génomes de L. monocytogenes et de L. innocua, une espèce non pathogène du genre Listeria. L'exploitation des séquences nous a permis d'entreprendre :

- des analyses transcriptomiques (en collaboration avec les laboratoires de P. Glaser et T. Msadek et d'autres groupes en France): en plus des analyses menées sur des souches inactivées pour différents régulateurs transcriptionnels, une analyse transcriptionnelle dans différentes conditions de croissance est menée pour caractériser les gènes dont l'expression est régulée dans les conditions environnementales rencontrées par L. monocytogenes (biofilms etc.)

- des analyses de biodiversité (en collaboration avec les Laboratoires de P. Martin et P. Glaser): l'analyse d'un grand nombre de souches de L. monocytogenes de différents sérovars a été entreprise afin d'identifier de nouveaux gènes responsables du pouvoir pathogène de L. monocytogenes.

- une recherche de nouveaux gènes de virulence par mutagénèse ciblée.

Nous avons inactivé des gènes présents chez L. monocytogenes et absents chez L. innocua ainsi que des gènes codant pour des proteines de surface. Les travaux en cours montrent que certaines de ces protéines de surface jouent un rôle pour l'entrée dans les cellules et affectent la virulence dans différents modèles animaux. Nous avons également inactivé un gène qui code pour une BSH, une hydrolase des sels biliaires. C'est un nouveau type de facteur de virulence régulé par PrfA qui joue un rôle dans la résistance à la bile et par voie de conséquence dans la persistance des bactéries dans la lumière intestinale. Ce gène est absent de toutes les souches de L. innocua et se révèle donc un nouvel outil d'identification des Listeria dans les aliments ou l'environnement. Nous avons aussi entrepris l'inactivation d'un système sérine/thréonine kinase.

L'inactivation du gène srtA, codant pour la sortase A de L. monocytogenes, abolit l'ancrage de plusieurs protéines de surface de la famille LPXTG et affecte la virulence. L'analyse du mutant srtA in vivo révèle que certains de ces gènes pourraient avoir un rôle dans les étapes très précoces de l'infection. Les rôles précis de ces gènes ainsi que celui du gène paralogue de srtA, srtB sont à l'étude.

VI. Rickettsia conorii : Un autre modèle pour l'analyse des mouvements intracellulaires et intercellulaires actine-dépendants ainsi que pour l'entrée dans les cellules (E. Gouin, J. Martinez, V. Villiers)

Nous avons pendant plusieurs années poursuivi l'étude de la protéine de surface de L. monocytogenes ActA et démontré en collaboration avec MF Carlier qu'ActA mime les protéines de la famille WASP et active le complexe Arp2/3. Nous nous intéressons maintenant à la motilité intracellulaire de Rickettsia conorii, une bactérie intracellulaire stricte qui possède une motilité dépendante de la polymérisation de l'actine, comme L. monocytogenes. Son mécanisme de polymérisation d'actine semble cependant original, puisque les filaments d'actine polymérisée sont longs, non branchés, fixés sur la bactérie et ne contiennent pas le complexe Arp2/3. Le séquençage du génome de R.conorii réalisé par le génoscope d'Evry nous a permis d'identifier un gène présent chez R. conorii et absent chez R. prowaseki, la bactérie responsable du typhus et incapable de polymériser l'actine. L'analyse du produit de ce gène révèle l'existence d'un mécanisme original de polymérisation de l'actine. Nous avons aussi récemment entrepris d'analyser les autres étapes de l'infection par cette bactérie qui sont totalement inconnus.

Fig. 1Listeria en mouvement circulaire. Illustration de la motilité intracellulaire dépendant de l'actine

Fig. 2Recrutement du recepteur à l'HGF (Met) au site d'entrée des bactéries internalisées par la voie InlB-dépendante.

Mots-clés: bactéries, virulence, biologie cellulaire, transcriptome, mutagénése



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Carton Isabelle, icarton@pasteur.fr Cossart, Pascale, Institut Pasteur, Professeur, pcossart@pasteur.fr

Dussurget, Olivier, Institut Pasteur, Chargé de Recherches, odussur@pasteur.fr

Khelef, Nadia, Institut Pasteur, Chargée de Recherches, nkhelef@pasteur.fr

Pizarro-Cerda, Javier, Institut Pasteur, Chargé de Recherches, pizarroj@pasteur.fr

Bierne, Hélène, INRA, Chargée de Recherches, hbierne@pasteur.fr

Huillet, Eugénie, INRA, Chargée de Recherches, ehuillet@pasteur.fr

Cabanes, Didier, Stagiaire post-doctorant IP/CEE ; dcabanes@pasteur.fr

Dupuis,Stéphanie, Stagiaire post-doctorante AFRT, sdupuis@pasteur.fr

Johansson, Jorgen, Stagiaire post-doctorant Werner Gren Foundation, jjohanss@pasteur.fr

Martinez, Juan, Stagiaire post doctorant EMBO, jmartine@pasteur.fr

Seveau, Stéphanie, Stagiaire post doctorante ARC, sseveau@pasteur.fr

Archambaud, Cristel, Doctorante, Boursière du Ministère de la Recherche, carcham@pasteur.fr

Mandin, Pierre, Doctorant Boursier du Ministère de la Recherche, pmandin@pasteur.fr

Sousa, Sandra, Doctorante, Boursière de la Fundaçao para a Ciencia e Tecnologia, ssousa@pasteur.fr

Sabet, Christophe, DEA, csabet@pasteur.fr

Gouin Edith, Institut Pasteur, Ingénieur position 3 egouin@pasteur.fr

Villiers Véronique, Institut Pasteur, Technicienne vvilliers@pasteur.fr

Carton Isabelle, Institut Pasteur, Secrétaire icarton@pasteur.fr


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