Portail IP   bandeau_genéral
Version PDF      Hépacivirus


  Responsable : MEURS Eliane (emeurs@pasteur.fr)


  resume

 

L'objectif de cette nouvelle Unité de Recherche est d'étudier l'interaction du virus de l'Hépatite C (VHC) avec les premières lignes de défense antivirales de la cellule ou " réponse immune innée" et de contribuer à la mise en place d'une augmentation de ces défenses cellulaires. Actuellement, il n'existe pas de système efficace de culture cellulaire du VHC, aussi nous developpons d'abord une stratégie pour permettre l'identification et l''enrichissement des cellules infectées. D'autre part, nous étudions le mécanisme d'action et la régulation de la PKR, une protéine kinase induite par l'interféron (IFN), qui est impliquée dans la réponse immune innée.



  rapport

cale

Identification et purification des cellules infectées par le VHC

(Collaborations avec Patrick Maurel, INSERM U-128, & Joliette Coste, EFS, Montpellier; Gilles Duverlie; Université de Picardie-Jules Verne, Amiens ; Ceslaw Wychowski, groupe Hepatite C (CNRS, FRE 2369), Institut de Biologie de Lille & Institut Pasteur de Lille ; Pierre Charneau, Virologie Moléculaire et Vectorologie, Institut Pasteur,Paris; Haralabia Boleti, laboratoire de Virologie Moléculaire, Institut Pasteur Hellénique; Athènes; Grèce).

Le virus de l'Hépatite C (VHC) infecte 3% de la population mondiale et provoque le développement d'hépatites chroniques dans 60 à 90% des patients infectés, pouvant conduire à des cirrhoses (0,5 à 30% des cas) et des carcinomes hépatocellulaires. C'est un virus enveloppé (famille des Flaviviridae; genre hépacivirus) dont le génome à ARN positif présente une forte hétérogénéité (6 génotypes distincts; différents sous-types et quasi-espèces). Actuellement, il n'existe pas de système de culture efficace et reproductible permettant l'amplification de particules virales, ce qui handicape les études sur ce virus. Cependant, même à très faible efficacite (moins de 1%), le VHC est tout de même capable d'infecter certaines cultures cellulaires, dont des cultures primaires d'hépatocytes humains, son hôte cellulaire naturel. Aussi, nous avons défini une stratégie visant à identifier et trier les cellules infectées par le VHC à partir de l'ensemble des cellules incubées avec un sérum infectieux. Pour cela, nous avons construit, puis inséré dans différents vecteurs d'expression eucaryote, des "outils moléculaires" qui ne s'activent qu'en présence du VHC et qui permettront de révéler les cellules infectées ou de les purifier. Cette approche sera utilisée pour (1) caractériser l'action du VHC sur les voies de signalisation des cytokines, (2) effectuer une analyse comparative du transcriptome des hépatocytes infectés et non infectés, traités ou non à l'interféron (IFN), une des cytokines impliquées dans la réponse immune innée et (3) établir l'impact de de certaines protéines cellulaires ou virales sur la réplication du virus.

Etude de la variabilité de la protéine NS5A du VHC de génotype 3a dans différents isolats de patients en fonction de leur sensibilité à l'interféron. (collaboration avec Gilles Duverlie; laboratoire de Virologie, Université de Picardie-Jules Verne et Centre Hospitalo-Universitaire, Hôpital-Sud, Amiens)

La bithérapie IFN pégylé/Ribavirine est le meilleur traitement à l'heure actuelle dans l'infection par le VHC, avec environ 60% de réponse. Les 40% de non-réponse restants peuvent s'expliquer par la capacité de certains génotypes viraux à mettre en place de mécanismes de résistance à l'IFN et d'évasion à la réponse immune de l'hôte. Une analyse de séquence sur un grand nombre de virus isolés de patients infectés par un des génotypes du VHC (génotype 1b) montre une corrélation entre la réponse du virus à l'IFN et la variabilité de séquence d'un région de la protéine non structurale NS5A du virus. Cette région a été appellée ISDR (IFN sensitivity Determining Region). Nous avons confirmé la corrélation entre la sensibilité à l'IFN et la variabilité de séquence de NS5A dans le cas de patients infectés avec un autre génotype du VHC (génotype 3a; séquence complète de NS5A sur 27 isolats) (Castelain et al, 2002, J I D 185 573-83.). Le mécanisme d'action anti-IFN de la protéine NS5A est, à ce jour, encore inconnu.

Mécanisme d'action de la PKR, une protéine kinase induite par l'interféron.

La PKR, ou Protéine Kinase dépendante d'ARN bicaténaire, est une protéine présente dans la plupart des cellules. Son expression est fortement induite en réponse au traitement par l'IFN et elle joue un rôle important dans les mécanismes de défenses antivirales au niveau cellulaire. La PKR s'active en kinase lorsqu'elle se lie à des structures d'ARN bicaténaires. De telles structures apparaissent fréquemment dans les cellules au cours d'une infection virale (génomes viraux présentant des ARNs double brin, formes intermédiaires de réplication, etc). Une fois activée, la PKR provoque l'arrêt des synthèses protéiques, en phosphorylant son substrat (eIF2a), une sous-unité d'un facteur cellulaire essentiel pour le démarrage de la traduction des ARNs messagers en protéines. Ainsi, en bloquant la synthèse protéique de la cellule infectée, l'action de la PKR participe à l'arrêt de la propagation virale dans l'organisme. Paradoxalement, la PKR agit également de façon positive sur l'expression de certains gènes, notamment en soutenant l'induction du gène de l'IFN. Pour cela, la PKR n'utilise pas sa fonction kinase mais entre directement en contact, par sa partie N terminale, avec un complexe de kinases (IKK) conduisant à l'activation du facteur de transcription NF-k B. Par ces deux mécanismes, la PKR participe donc de façon importante à l'action antivirale de l'IFN: 1) en bloquant les synthèses protéiques dans la cellule infectée, 2) en participant aux mécanismes d‘induction de l'IFN via l'activation de NF-k B, ce qui renforce la protection des autres cellules (Bonnet et al, soumis).

Régulation positive de la traduction par TRBP de façon dépendante et indépendante de la PKR (collaboration avec Catherine Vaquero, INSERM U511, Hôpital La Pitié-Salpêtrière; et Anne Gatignol; Lady Davis Institute for Medical Research,; Montreal)

TRBP (HIV-1 transactivating response (TAR) RNA Binding Protein) est une protéine cellulaire qui, comme la PKR, peut se lier à des structures d'ARN bicaténaires. Son ADNc a été initialement isolée d'une banque d'expression sondée par l'ARN TAR, une région ARN bicaténaire présente en amont de tous les transcrits du VIH-1, le virus de l'Immunodéficience Humaine. Nous nous intéressons à la protéine TRBP car elle forme des hétérodimères avec la PKR, au niveau de leurs domaines respectifs de liaison aux ARNs bicaténaires. Elle se conduit alors comme un inhibiteur de la fonction kinase de la PKR et peut donc gêner l'action antivirale de l'IFN. Des expériences de traduction in vitro dans des lysats de réticulocytes de lapin mettent facilement en évidence ce pouvoir inhibiteur de TRBP sur la PKR. Dans un tel système, des ARNs messagers possédant une structure à ARN bicaténaire en amont de leur séquence codante se traduisent très mal et activent la PKR, ce qui peut être révélé par la phosphorylation d'eIF2a (voir § sur PKR). L'addition de TRBP à ce système restaure l'efficacité de traduction et inhibe la phosphorylation d'eIF2a. Récemment, nous avons mis en évidence que TRBP, outre son rôle inhibiteur de PKR, joue également un rôle stimulateur direct de la traduction de ces ARNs messagers, par son interaction avec l'ARN bicaténaire. L'action de TRBP serait de permettre une déstabilisation des structures à ARN bicaténaires et de favoriser leur accès aux ribosomes puis leur traduction. TRBP agit donc comme un facteur cellulaire important pour la traduction des ARNs messagers contenant des structures bicaténaires, à la fois en inhibant la PKR et de façon indépendante de la PKR. Dans le contexte d'une infection virale, il est donc crucial de connaitre les actions relatives de PKR et de TRBP afin de pouvoir augmenter le pouvoir antiviral de PKR (Dorin et al, J Biol Chem in press-online ).

Mots-clés: Virus de l’Hépatite C, cytokines, voies de signalisation, PKR, Virologie



  publications

puce Toutes les publications sur notre base de données


  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  TALPIN Evelyne, evtalpin@pasteur.fr Meurs Eliane,Chef laboratoire IP,emeurs@pasteur.fr BREIMAN Adrien Doctorant,abreiman@pasteur.fr,

COLLINET Emilie IUT

OTTONE Catherine Technicienne Supérieure,cottone@pasteur.fr

PECHBREIL Emmanuelle CDD IP


Rapports d'activité 2002 - Institut Pasteur
filet

Debut de Page recherche Portail Institut Pasteur

En cas de problèmes, de remarques, ou de questions concernant cette page Web écrire à rescom@pasteur.fr