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Version PDF      Génétique Moléculaire des Virus Respiratoires - URA 1966 CNRS


  Responsable : Sylvie van der WERF (svdwerf@pasteur.fr)


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Les activités de l'unité sont centrées sur la génétique moléculaire des virus à ARN positif ou négatif (virus grippaux, picornavirus, hépacivirus). Elles portent sur l'étude des mécanismes moléculaires de l'expression et de la réplication des génomes viraux et de leur emploi comme vecteurs d'expression, l'analyse des interactions fonctionnelles entre le virus et son hôte et de la pathogenèse des infections, l'épidémiologie moléculaire et l'étude de la variabilité des génomes viraux.



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I. "GÉNÉTIQUE MOLÉCULAIRE DES VIRUS RESPIRATOIRES" responsable Sylvie van der WERF

a) Génétique moléculaire des complexes de transcription/réplication des virus grippaux (Nadia NAFFAKH, Pascale MASSIN, Bernadette CRESCENZO-CHAIGNE, Monika MARASESCU)

Nous avons poursuivi l'identification, au sein des gènes codant pour le complexe de transcription/réplication, des déterminants moléculaires de la spécificité de type et de la spécificité d'espèce des virus grippaux en utilisant un système d'expression transitoire en cellules eucaryotes permettant d'exprimer les 3 sous-unités du complexe polymérase (PB1, PB2, et PA) ainsi que la nucléoprotéine NP, et de suivre la transcription/réplication d'un ARN pseudo-viral porteur d'un gène rapporteur. Ainsi, ayant montré que la nature de certains nucléotides et la stabilité de la structure secondaire des extrémités de l'ARN viral sont des déterminants importants de la spécificité de type, nous avons mis en évidence une plus grande spécificité du complexe polymérase de type C que de type A vis-à-vis de ces déterminants. Par ailleurs, l'analyse des ARN synthétisés a révélé que d'une façon générale le complexe polymérase de type A initie préférentiellement la synthèse de mARN sur les pseudo-ARN viraux alors que le complexe de type C initie préférentiellement la synthèse de cARN. Afin de comprendre en quoi l'initiation préférentielle de mARN versus cARN joue un rôle au cours de la multiplication virale, nous avons entrepris d'étudier l'effet des mutations après introduction par génétique inverse dans le contexte d'un virus infectieux.

L'étude des complexes polymérase issus de virus d'origine humaine et d'origine aviaire nous avait permis de montrer que le résidu 627 de PB2 détermine la sensibilité du complexe polymérase à basse température, suggérant qu'une moindre capacité du complexe polymérase à assurer la réplication du génome viral à 33°C pourrait contribuer à l'incapacité des virus aviaires à se multiplier efficacement chez l'homme. Nous avons également établi que la nature de l'acide aminé 118 de PA détermine la moindre sensibilité à basse température de la souche d'origine aviaire A/Hong Kong/156/97 (H5N1), responsable d'un cas humain de grippe mortelle, et pourrait par ce biais avoir contribué à la capacité de ce virus aviaire à se multiplier efficacement dans le tractus respiratoire supérieur chez l'homme. Par ailleurs, nous avons montré que l'efficacité de reconnaissance des séquences promotrices des extrémités de l'ARN viral par le complexe polymérase varie selon la souche virale dont dérive le complexe et notamment selon la nature du résidu 627 de PB2.

b) Vecteurs viraux et vaccinologie(Nicolas ESCRIOU, Alexandre VIEIRA-MACHADO, India LECLERCQ, Sylvie GERBAUD, Christophe BATEJAT)

Immunisation génique à base d'ARN nu au moyen de réplicons recombinants

Ayant précédemment montré que des réplicons dérivés du virus Mengo (MV) permettant l'expression de la nucléoprotéine (NP) du virus grippal sont capables, après injection sous forme d'ARN nu à la souris, d'induire une immunité protectrice vis-à-vis d'une infection d'épreuve par le virus grippal, nous avons entrepris de généraliser cette observation en démontrant la capacité de réplicons MV recombinants exprimant des séquences de la NP du virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV) à induire une immunité protectrice vis à vis d'une injection d'épreuve par le LCMV. Par ailleurs, nous avons entrepris le développement de réplicons dérivés du génome du MV permettent l'expression d'une protéine glycosylée telle que l'hemagglutinine (HA) du virus grippal selon une approche similaire à celle que nous avions développée pour les réplicons dérivés du poliovirus.

Production de virus grippaux transfectants à segment bicistronique par génétique inverse

Par génétique inverse, des virus grippaux transfectants porteurs d'un segment bicistronique dérivé du segment 6 codant pour la neuraminidase (NA) ont été obtenus. La stratégie employée consiste en une duplication des séquences 3' non-codantes du segment d'ARN génomique rendant le segment dicistronique pour la transcription/réplication puisqu'il dirige alors la synthèse de vARN, cARN et mARN génomiques et subgénomiques. L'étude des conditions d'expression de différents gènes rapporteurs, comme CAT et GFP, nous a permis d'établir que la taille de l'insert ou la nature de certaines séquences affecte négativement la viabilité des virus. Nous avons entrepris de généraliser cette approche à l'expression d'autres séquences hétérologues (antigène HBs, NP du LCMV) ainsi qu'à d'autres segments du virus grippal. Enfin, ayant mis en évidence l'importance du maintien de certaines séquences codantes du segment NA pour la viabilité des virus à segments bicistroniques, nous avons abordé l'étude du rôle de ces séquences au cours du cycle viral.

c) Epidémiologie moléculaire et évolution des virus grippaux

Evolution de la spécificité des glycoprotéines de surface, l'hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA) d'isolats grippaux A(H3N2) récents pour les acides sialiques. (Rita MEDEIROS, Nadia NAFFAKH, Nicolas ESCRIOU, Jean-Claude MANUGUERRA)

Partant de l'observation initiale que les isolats récents de virus grippaux A(H3N2) ont perdu la capacité d'agglutiner les globules rouges de coq, nous avons montré que cette propriété dépend notamment de la nature du résidu de la HA en position 226. Des variations séquentielles de ce résidu sont observées depuis l'introduction chez l'homme des virus A(H3N2) à l'origine de la pandémie de 1968. Ces variations ne sont pas corrélées à un changement de spécificité vis-à-vis des acides sialiques en liaison SAa2,6Gal, mais pourraient plutôt altérer l'affinité de la HA pour ces récepteurs et ainsi contribuer à l'adaptation du virus à son hôte. Nous avons également montré que le résidu 193, très conservé au sein de chaque groupe de virus infectant un hôte spécifique, est impliqué dans la spécificité de la HA vis-à-vis des acides sialiques, de type N-Acétyl ou N-glycolyl en liaison SAa2,3Gal, mais que cette spécificité est également déterminée par le contexte général de la séquence de la HA.

Parallèlement nous avons abordé l'étude de l'évolution de la NA d'isolats grippaux A(H3N2) récents pour lesquels des variations de spécificités et/ou d'affinité vis-à-vis des acides sialiques ont été mises en évidence.

d) Centre National de Référence du Virus Influenzae (Région Nord) et Centre collaborateur de l'OMS pour la référence et la recherche sur les virus grippaux et les autres virus respiratoires (Sylvie van der WERF, Jean-Claude MANUGUERRA, Maryse TARDY-PANIT, Saliha AZEBI, Valérie LORIN, Claudine ROUSSEAUX)

En tant que Centre de Référence, l'unité contribue à la surveillance des virus grippaux et d'autres virus respiratoires au niveau national par le biais du réseau de laboratoires hospitaliers RENAL et du réseau des GROG (Groupes Régionaux d'Observation de la Grippe), et au niveau international notamment européen, par échange télématique des données dans le cadre du groupe EISS (European Influenza Surveillance Scheme), et par l'animation du réseau EUROGROG. Par sa contribution à la Cellule d'Alerte et de Réponse aux Epidémies, le Centre a également participé à l'investigation de phénomènes épidémiques associés à une mortalité élevée dans des pays africains à l'invitation de l'OMS et d'ONG comme MSF. L'isolement, l'identification, la caractérisation antigénique ainsi que la caractérisation génétique des virus respiratoires sont réalisés à partir des prélèvements de cas d'infections respiratoires de type syndrome grippal adressés au Centre. Au cours de la saison 2001/2002, l'épidémie de grippe a été modérée avec co-circulation des virus de type A et B. Les virus A(H3N2) ont largement prédominé et ont été caractérisés comme antigéniquement apparentés à la souche A/Panama/2007/99(H1N1) inclue dans la composition vaccinale. Les virus grippaux A de sous-type H1, minoritaires, étaient antigéniquement proches de la souche vaccinale A/New Caledonia/20/99. Toutefois, l'événement marquant de cette saison a été l'apparition d'un nouveau sous-type viral A(H1N2) résultant d'un réassortiment ayant permis aux virus A(H3N2) d'échanger le segment H3 avec celui des virus A(H1N1). En ce qui concerne les virus de type B, ils étaient soit proches mais antigéniquement distincts de la souche vaccinale B/Yamanashi/166/99, soit apparentés aux virus du lignage B/Victoria/2/87 dont fait partie la souche B/Hong Kong/330/2001, inclue dans la composition vaccinale de la saison 2002-2003.L'unité assure également la caractérisation antigénique et génétique des virus grippaux animaux isolés chez les porcs, les chevaux ou encore l'avifaune.

II. "VIRUS des HÉPATITES" responsable Annette MARTIN

Etude in vitro et in vivo de différentes étapes du cycle viral des virus de l'hépatite C et GBV-B. Développement d'un modèle animal de petite taille pour l'étude de la physiopathologie de l'hépatite C. (Annette MARTIN, Lisette COHEN, David GHIBAUDO)

Pour pallier l'absence de système cellulaire permettant la multiplication du virus de l'hépatite C (VHC) in vitro et de modèle animal autre que le chimpanzé, nous avons recours au virus GB-B (GBV-B), dont l'organisation génomique est la plus proche de celle du VHC parmi les Flaviviridae. Le GBV-B est responsable d'une hépatite chez de petits primates du Nouveau Monde tels le tamarin et le marmouset, et se multiplie ex vivo dans des cultures d'hépatocytes primaires de ces espèces. L'analyse de l'infectivité chez le tamarin de clones moléculaires chimères du GBV-B contenant divers segments de la région 5' non codante (5'NC) du VHC en substitution des séquences équivalentes du GBV-B a permis de caractériser des signaux de réplication de l'ARN au sein de la région 5'NC du génome viral. D'autre part, cette étude a fourni un virus GBV-B chimère porteur du domaine impliqué dans l'initiation de la traduction par entrée interne des ribosomes (IRES) du VHC, qui se réplique chez le petit primate et qui sera précieux pour l'évaluation d'anti-viraux ciblant la traduction du VHC dans ce modèle animal (coll. S.M. Lemon, U.T.M.B., Galveston, TX, USA & R.E. Lanford, S.F.B.R., San Antonio, TX, USA).

Nous procédons par ailleurs à une caractérisation des protéines du GBV-B, notamment des protéines structurales. A l'aide de baculovirus recombinants, nous avons montré que des précurseurs structuraux GBV-B/VHC hybrides sont découpés de façon fidèle par les signalases cellulaires, et qu'il est possible d'assembler en pseudo-particules virales la protéine de capside du GBV-B avec les protéines d'enveloppe du VHC (Coll. M-C. Prévost, Plateforme Microscopie Electronique). La génétique inverse appliquée à des réplicons du VHC nous permet d'affiner les connaissances des déterminants moléculaires du découpage de la polyprotéine virale et de la réplication de l'ARN viral dans des lignées cellulaires d'origine hépatocytaire. Ces études constituent également des préliminaires importants à la création de clones moléculaires GBV-B/VHC hybrides obtenus par échange de séquences codant pour tout ou partie des protéines de structure ou de réplication. L'étude de l'infectivité de ceux-ci après inoculation intrahépatique in vivo permettra d'identifier les déterminants moléculaires de la spécificité d'hôte de ces hepacivirus et de produire des outils pour l'étude de l'infection à VHC chez le petit primate.

Mots-clés: grippe, hépatite C, picornavirus, replication, vaccin, vecteur, virologie, épidémiologie moléculaire, modèle animal



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  NAUBRON Christine, Institut Pasteur, secrétaire de direction,cnaubron@pasteur.fr COHEN Lisette, Université Paris 11, MC1,lisemc@pasteur.fr

ESCRIOU, Nicolas, Institut Pasteur, CR,escriou@pasteur.fr

LECLERCQ, India, Université Paris 7, ATER,ileclerc@pasteur.fr

MARTIN Annette, Institut Pasteur, CR,annettem@pasteur.fr

MANUGUERRA Jean-Claude, Institut Pasteur, CR,jmanugu@pasteur.fr

NAFFAKH Nadia, CNRS, CR1,nnaffakh@pasteur.fr

van der WERF Sylvie,Université Paris 7, PR1 & Institut Pasteur, Chef de Laboratoire,svdwerf@pasteur.fr

GHIBAUDO David, Université Paris 7, doctorant

MASSIN Pascale, Université Paris 6, doctorant

MEDEIROS Rita, Université Paris 7, doctorant

VIEIRA MACHADO Alexandre, Université Paris 7, doctorant

CRESCENZO-CHAIGNE Bernadette, Institut Pasteur, Ingénieur de Recherche

GERBAUD Sylvie, Institut Pasteur, Ingénieur de Recherche

TARDY-PANIT Maryse, Institut Pasteur, Ingénieur Technologue

AZEBI Saliha, Institut Pasteur, Technicienne CDD

BATEJAT Christophe, Institut Pasteur, Technicien, CDD

LORIN Valérie, Institut Pasteur, Technicienne Supérieure

MARASCESCU Monika, Institut Pasteur, Technicienne

ROUSSEAUX Claudine, Institut Pasteur, Technicienne Supérieure

ANSELME-VATIN Alex, Institut Pasteur, Aide de Laboratoire

BLIN Josiane, Institut Pasteur, Aide de Laboratoire

FILLODEAU Anne-marie, Institut Pasteur, Aide de Laboratoire


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