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Version PDF      Génétique Moléculaire du Développement - URA CNRS 1947


  Responsable : Margaret BUCKINGHAM (margab@pasteur.fr)


  resume

 

Nos recherches sont centrées sur l'étude de la myogenèse dans le but de comprendre comment les cellule progénitrices sont spécifiées chez l'embryon pour permettre la mise en place de différentes masses musculaires du squelette et du cœur pendant le développement. Nous sommes également intéressés par les cellules progénitrices du muscle chez l'adulte et la contribution de cellules souches à la régénération. Le modèle expérimental est la souris, avec manipulation de gènes de régulation myogénique.



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La formation du muscle de squelette [Lola Bajard, Ted Chang, Philippe Daubas, Didier Montarras, Frédéric Relaix, Didier Rocancourt, Ralf Spörle,— collaborations avec les laboratoires de G. Cossu, A. Cumano, P. Maire, T. Partridge, M. Polimeni, C. Ponzetto, P. Rigby, B. Schäfer]

En 1997 nous avions démontré que Myf5 et Pax3 se situent en amont de MyoD dans la hiérarchie génétique qui régule la myogenèse. Actuellement nos recherches se focalisent sur la régulation, et la fonction de ces deux gènes.

La régulation du gène Myf5 a été abordée par une approche de transgenèse chez la souris, en utilisant des YACs portant de grands fragments d'ADN autour de Myf5, ciblé avec le gène rapporteur nlacZ. Ainsi, nous avons mis en évidence, différentes régions, allant jusqu'à -96 kb en amont de Myf5, qui contrôlent l'expression spatiotemporelle de ce gène de détermination myogénique. Plusieurs enhanceurs sont impliqués dans cette régulation, dont un à -6 kb qui est essentiel pour la transcription la plus précoce de Myf5 dans la partie épaxiale des somites, avant la formation du muscle. Un autre enhanceur, que nous avons identifié à -58/-48 kb est composé de plusieurs éléments qui ciblent spécifiquement les sites de transcription de Myf5 dans les somites, la corde hypoglosse et les membres, ainsi que dans le système nerveux où la protéine Myf5 n'est pas détectée. La délétion de cet enhanceur, dans le contexte du locus, montre son rôle essentiel. Cette analyse révèle la multiplicité de séquences qui se complémentent pour orchestrer la formation du muscle. Dans le somite, par exemple, au moins six séquences ciblent les populations de cellules distinctes qui contribuent aux différentes phases de la myogenèse. Parmi ces cellules, nous portons un intérêt particulier à celles qui participent à la formation de la région intercalée, située à la frontière entre la partie épaxiale et hypaxiale du somite, qui est caractérisé par l'expression de En1. Une autre approche à la régulation de Myf5, par un "piège à enhanceur", dans les cellules myogéniques en culture, nous a permis d'isoler une séquence activatrice, à -17 kb, avec des propriétés intéressantes. Le gène de Myf5 se trouve en aval d'un gène qui code un autre facteur myogénique, Mrf4, avec un profil d'expression différent. La séquence à -17 kb de Myf5 se comporte différemment avec les deux promoteurs. Nous avons ciblé le gène Mrf4 avec un deuxième gène rapporteur (le phosphatase alkaline), qui nous a permis d'étudier le rapport de force entre les deux promoteurs, Myf5 ou Mrf4, par rapport aux autres séquences régulatrices du locus. La délétion de la séquence à -17 kb suggère qu'il joue un rôle clé dans l'organisation du locus, favorisant, par exemple, une configuration qui permet à l'enhanceur à -58/-48 kb d'interagir avec le promoteur de Myf5.

La caractérisation d'éléments qui ciblent les sites particuliers de myogenèse nous permet maintenant de remonter la filière vers les facteurs et voies de signalisation impliqués dans leur activation et aussi de les utiliser pour manipuler in vivo le réseau de régulation moléculaire qui spécifie l'identité musculaire d"une population de cellules.

Le ciblage du gène endogène, Myf5, avec le gène rapporteur nlacZ, par recombinaison homologue, nous avait permis d'étudier le rôle essentiel de ce facteur de détermination myogénique chez l'embryon. L'allèle Myf5-nlacZ est également exprimé dans les cellules satellites qui sont requises pour la régénération du muscle adulte. Myf5 et MyoD interviennent dans ce processus, mais le rôle des gènes Pax et particulièrement Pax7, l'orthologue de Pax3, est critique et ne peut pas être complémenté par Myf5. Le ciblage du gène Pax3 avec le gène rapporteur nlacZ nous a permis de voir que Pax3 est également exprimé dans les cellules satellites de certains muscles. Dans le mutant Pax7 -/-, il y a un bas niveau de régénération et la différenciation des cellules satellites restantes dépend de Pax3. Par manipulation de Pax3, Pax7 et les formes dominant négatives ou constitutivement actives de Pax3, dans les cultures du muscle adulte, nous examinons le rôle de Pax3 dans la prolifération et différenciation de ces cellules.

Nous nous intéressons aussi à la problématique des cellules souches chez l'adulte, au potentiel myogénique/haematopoiétique des cellules de la moelle osseuse aussi bien que celles du muscle, et à l'éventuel rôle de Pax3 dans la réalisation du potentiel myogénique des mésangioblastes, présents dans les parois des vaisseaux sanguins.

Chez l'embryon, Pax3 joue un rôle dominant, par rapport à Pax7, dans la formation du muscle de squelette . Par l'introduction de la séquence codante de Pax7 dans une allèle de Pax3, également marqué avec le gène rapporteur nlacZ, nous avons pu étudier le comportement de cellules qui expriment Pax7 à la place de Pax3. Nous constatons que Pax7 ne peut que partiellement remplir les fonctions de Pax3. Les résultats sont particulièrement intéressants au niveau des membres, mettant en évidence les différences entre membre antérieur et postérieur et entre la formation de masses musculaires proximales et distales.

Pax3, lui-même, est peu actif comme facteur de transcription et la question de son rôle comme activateur ou répresseur chez l'embryon se pose. Chez l'homme, une translocation chromosomale crée une protéine de fusion PAX3-FKHR qui est à l'origine d'une classe de rhabdomyosarcomes. Cette protéine, qui garde le domaine de fixation à l'ADN de PAX3, avec le domaine de transactivation de FKHR, est un puissant activateur de transcription. Nous avons ciblé un allèle de Pax3 avec une séquence PAX3-FKHR-IRESnlacZ qui nous a permis de démontrer que la protéine PAX3-FKHR fonctionne comme Pax3, et peut sauver le phénotype du mutant Pax3 -/-. Pax3 est donc un activateur de la transcription chez l'embryon et nous avons isolé plusieurs candidats co-activateurs, dans ce contexte. La protéine PAX3-FKHR suractive les cibles de Pax3 telle que c-met et le suivi des cellules qui expriment cet allèle donne des aperçus nouveaux sur la fonction de Pax3 pendant la myogenèse.

Les cibles de Pax3 sont relativement mal connues et nous nous intéressons à l'éventuelle cascade de régulation myogénique - Pax3-Six1/4-MyoD -, étudiée par l'introduction d'une séquence encodant une forme dominant négative de l'homéoprotéine Six dans un allèle de Pax3.

Cardiogenèse[Robert Kelly, Marguerite Lemonnier, Sigolène Meilhac, Emmanuel Pecnard, Stéphane Zaffran – collaborations avec les laboratoires de N. Brown et J.-F. Nicolas]

L'expression régionalisée de certains transgènes, exprimés dans le muscle cardiaque, nous a fourni un outil intéressant pour suivre différents sous-domaines du myocarde, aussi bien in vivo, pendant le développement du coeur normal, que in vitro. Ainsi avec les explants du tube cardiaque précoce nous avons pu définir une fenêtre de temps pendant laquelle l'identité des oreillettes gauche/droite reste flexible, tandis que le ventricule l'a déjà acquise. Le développement des vecteurs adénoviraux qui expriment différentes molécules de signalisation et de facteurs de régulation, nous permet de manipuler l'acquisition de cette identité sur l'axe gauche/droite, ainsi éventuellement que celle du ventricule sur l'axe antérieur/postérieur.

Une lignée transgénique particulière a été très informative sur la contribution inattendue de cellules, provenant du mésoderme antérieur, au myocarde du pôle artériel du coeur. Ce phénomène est confirmé par le suivi de ces cellules, marquées par injection de DiI, dans les embryons en culture. L'origine de cette partie du coeur est restée longtemps obscure. Il est clair maintenant, à la suite de nos observations chez l'embryon de la souris et des travaux récents d'autres laboratoires chez le poulet, qu'il existe une deuxième source de cellules précurseurs du coeur. Les cellules sont situées d'abord médiales au croissant cardiaque où se trouvent les premiers cardiomyocytes puis, suivant les mouvements des masses cellulaires qui accompagnent le développement de cette région, antérieures au tube cardiaque qui s'est formé par fusion du croissant et qui s'accroît par l'addition de cellules postérieurement. Les cellules provenant du champ cardiaque antérieur, que nous avons mises en évidence, s'ajoutent à la partie antérieure du tube cardiaque pour former la voie efférente du coeur et également une partie importante du ventricule droit. Les expériences avec d'une part les explants provenant de la lignée dont l'expression du transgène marque cette région, et d'autre part les explants d'autres lignées transgéniques qui marquent différentes régions du myocarde, confirment que le ventricule primitif a essentiellement une identité "gauche".

L'expression du transgène dans le champ cardiaque antérieur est probablement due au site d'intégration, s'agissant d'un effet de ''piège'' d'élément de régulation du gène Fgf10, qui se trouve à proximité du transgène, et dont le patron de transcription est très semblable. Nous recherchons actuellement cet élément qui nous permettra de manipuler l'expression de Fgf10 et d'autres molécules dans le champs artérieur cardiaque. L'étude du rôle de Fgf10 dans ce contexte se poursuit avec l'analyse des mutants Fgf10-/- et les expériences d'explants.

La question de l'origine des populations de cellules qui colonisent les différentes parties du cœur peut également être abordée par analyse clonale rétrospective . Dans ce but, nous avons ciblé le gène de l'actine cardiaque avec un gène rapporteur nlaacZ. Un événement de recombinaison rare rend le gène fonctionnel, (nlacZ), avec marquage par la b -galactosidase des cellules qui expriment l'actine cardiaque. L'analyse des clones ainsi visualisée chez l'embryon nous permet d'étudier le comportement et la croissance de cellules qui forment le myocarde. Nous distinguons une phase de croissance dispersive, suivie d'une phase cohérente caractérisée par les orientations particulières des cellules. En général les cellules d'un même clone se distribuent le long de l'axe antérieur/postérieur du coeur. L'analyse de la distribution de cellules marquées dans les différentes régions cardiaques donne des aperçus nouveaux sur la morphogenèse du coeur. Dans le contexte du champs antérieur cardiaque, par exemple, nous constatons une régionalisation clonale entre ventricule droit et gauche consistante avec une origine différente des cellules de ces deux compartiments.

Photo 1: Le gène, Pax3, ciblé par un rapporteur, nlacZ, révèle les défauts de myogenèse et du système nerveux chez les embryons mutants A. Un embryon hétérozygote âgé de 11.5 jours B. Un embryon homozygote âgé de 11.5 jours .Les flèches rouges montrent les défauts du tube neural dorsal; les flèches vertes montrent les défauts du système nerveux périphérique ; les flèches noires montrent le manque de précurseurs musculaires migratoires; les flèches blanches montrent les défauts dans les somites.

Photo 2: Lignage de cellules du myocarde Le marquage de cellules dérivant d'un même précurseur (en bleu), vu ici dans un cœur embryonnaire de souris (OD : oreillette droite ; OG : oreillette gauche ; VD : ventricule droit ; VG : ventricule gauche), permet de mettre en évidence les mécanismes cellulaires de la morphogenèse du cœur.

Mots-clés: Myogenèse, Cardiogenèse



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