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Version PDF      Génétique des Interactions Macromoléculaires


  Responsable : Jacquier Alain (jacquier@pasteur.fr)


  resume

 

Nous étudions divers aspects du métabolisme des ARN chez la levure Saccharomyces cerevisiae (maturation, transport, dégradation). En 2002, nous avons particulièrement mis l'accent sur la maturation des ribosomes en étudiant : 1) un nouveau petit ARN nucléolaire responsable de la formation de deux pseudouridines universellement conservées dans l'ARNr ainsi que le rôle de ces deux pseudouridines ; 2) un nouveau mécanisme d'autorégulation d'une protéine ribosomique qui fait intervenir la dégradation de sont propre ARNm ; 3) la caractérisation et l'assemblage des particules particules pré-60S, précurseurs de la grande sous-unité ribosomique.



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La thématique générale du laboratoire est l'analyse du métabolisme des ARN chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Ces voies métaboliques regroupent de nombreuses étapes qui vont de la transcription de ces molécules dans le noyau, jusqu'à leur dégradation dans le cytoplasme en passant par les étapes de maturation ainsi que le transport nucléocytoplasmique. Nous utilisons différentes techniques génériques comme le double-hybride (ou le triple-hybride ARN), les purifications biochimiques par affinité (TAP) et des cribles génétiques (cribles de co-létalité par exemple) afin d'identifier la fonction de nouveaux facteurs impliqués dans ces voies métaboliques. La combinaison de ces trois approches génériques nous permet de cerner l'étape dans laquelle sont impliqués ces facteurs. Nous faisons alors une analyse classique de ces candidats en réalisant des tests fonctionnels spécifiques de l'étape identifiée afin d'affiner leur caractérisation.

En 2002, ces études nous ont amené à nous intéresser plus particulièrement à plusieurs aspects relatifs à la formation des particules ribosomiques. On peut ainsi identifier trois sujets articulés autour de cette thématique : 1) l'étude d'un nouveau mécanisme d'autorégulation post-transcriptionnelle de la synthèse d'une protéine ribosomique ; 2) l'identification d'un nouveau petit ARN nucléolaire (snoRNA) de type H/ACA ciblant la modification des deux seules pseudouridines universellement conservées dans l'ARNr ainsi que l'étude du phénotype associé à l'absence de ces deux pseudouridines ; 3) la caractérisation et l'étude de l'assemblage des particules pré-60S, précurseurs de la grande sous-unité ribosomique.

Identification chez la levure du petit ARN nucléolaire ciblant la modification des deux pseudouridines universelles de l'ARN de la grande sous-unité ribosomique.

L'ARN ribosomique, en particulier chez les eucaryotes, contient un grand nombre de nucléotides modifiés. Les modifications les plus communes sont de deux types : les méthylations en 2' des riboses et les pseudouridylations. Chez les eucaryotes, de petits ARN guides, les snoRNA, spécifient la position de ces modifications dans l'ARNr. Les positions des sites de méthylation en 2' des riboses et des pseudouridylations sont guidées respectivement par les snoRNA à boîtes C/D et à boîtes H/ACA. Le rôle de ces modifications reste mal compris puisque, jusqu'à présent, aucun phénotype clair n'a pu être attribué à l'absence de modification à un site spécifique. Nous avons maintenant identifié et caractérisé chez la levure un nouveau snoRNA H/ACA intronique, que nous avons appelé snR191, qui guide la pseudouridylation des positions 2258 et 2260 de l'ARN 25S de la grande sous-unité ribosomique. L'identification de ce nouveau snoRNA est particulièrement intéressante car les modifications qu'il spécifie sont les deux seules pseudouridines universellement conservées dans l'ARN ribosomique, des bactéries à l'homme. Le snoRNA humain correspondant est hU19. Nous avons pu montrer que la présence de ce petit ARN n'est pas essentielle à la vie de la cellule mais lui procure un avantage en termes de vitesse de croissance. Des études complémentaires seront nécessaires afin d'identifier plus précisément le rôle biochimique joué par ces pseudouridines dans le ribosome.

Un nouveau mécanisme d'autorégulation post-transcriptionnelle de l'expression d'une protéine ribosomique.

Dans les levures en croissance, la synthèse des ribosomes consomme une énorme partie des ressources de la cellule. L'expression des protéines ribosomiques est de ce fait étroitement régulée. Chez la levure et, contrairement aux procaryotes, l'essentiel de cette régulation semble s'effectuer au niveau transcriptionnel. Cependant, plusieurs mécanismes de régulation post-transcriptionnelle fine ont pu être mis en évidence pour quelques protéines ribosomiques chez la levure. Les mécanismes mis en jeu opèrent à diverses étapes, comme l'épissage ou la traduction.

L'analyse d'un réseau d'interactions double-hybrides construit au laboratoire révèle q'une protéine de fonction inconnue, Yel015p, est reliée de manière multiple et spécifique à des protéines cytoplasmiques impliquées dans le "decapping" et la dégradation des ARNm (Fromont-Racine et al. (2000) Yeast, 17, 95-110). L'absence de cette protéine n'affecte pourtant pas la stabilité globale des ARNm dans la cellule. Nous avons donc fait l'hypothèse que cette protéine était impliquée dans la dégradation de messagers spécifiques. L'analyse du transcriptome d'une souche dépourvue de Yel015p par l'utilisation de puces à ADN nous a permis d'identifier une cible de cette protéine. Il s'agit d'un ARN messager codant pour une protéine ribosomique et dont le niveau augmente lorsque la protéine Yel015p est absente et diminue lorsqu'elle est surproduite. De plus, les études par "Northern blot" montre que protéine ribosomique est capable d'autoréguler le niveau de son propre ARNm, mais que cette auto-régulation dépend de Yel015p. Le messager de cette protéine ribosomique possède un long 3'-UTR qui contient une structure tige-boucle conservée chez différentes espèces de levures. Nous avons pu montrer que cette tige-boucle était la cible de la machinerie impliquée dans le mécanisme d'autorégulation. Par ailleurs, il existe un lien double-hybride entre cette protéine ribosomique et Yel015p. Notre hypothèse de travail est que cette protéine ribosomique régule le taux de son propre ARN messager en se fixant sur son 3'UTR au niveau de la tige-boucle conservée. L'interaction entre la protéine et Yel015p permettrait alors le recrutement du complexe de décapping/degradation des ARN. Dans ce nouveau mécanisme d'autorégulation, l'étape de dégradation de la queue de polyA serait court-circuitée, ce que nous avons pu vérifier expérimentalement.

Analyse de la dynamique d'assemblage des complexes pré-ribosomiques et caractérisation des facteurs impliqués.

Chez les eucaryotes, la biogenèse des ribosomes commence dans le nucléole et se poursuit par des étapes de maturation et d'export dans le nucléoplasme et le cytoplasme. Pendant cette maturation, les précurseurs des ARN ribosomiques matures vont êtres modifiés et clivés au sein de larges particules ribonucléoprotéiques.

Tout récemment, par purification par affinité et identification par spectrométrie de masse, nous avons caractérisé plusieurs nouveaux complexes intermédiaires de maturation des ribosomes chez S. cerevisiae. Nous avons ainsi identifié environ 50 facteurs pré-ribosomiques associés physiquement aux complexes précurseurs de la grande sous-unité. A partir de la purification de complexes bloqués à des étapes précises par l'utilisation de mutations conditionnelles, nous déterminons l'ordre d'assemblage et de dissociation des facteurs pré-ribosomiques au cours de la formation des particules 60S matures. Par ailleurs, selon une analyse classique et ciblée, nous étudions le rôle que joue certains des nouveaux facteurs dans la biogenèse des ribosomes.

Nos données actuelles nous permettent de construire un modèle dans lequel l'association de certains facteurs pré-ribosomiques aux complexes pré-60S dépend de la présence d'autres protéines pré-ribosomiques dans ces particules.

Mots-clés: biogenèse des ribosomes, snoRNA, dégradation des ARNm, purifications TAP, maturation de l'ARNr



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  LABOUISE Odile (labouise@pasteur.fr) FROMONT-RACINE Micheline, CNRS, CR2, (mfromont@pasteur.fr)

SAVEANU Cosmin , Institut Pasteur, Chargé de recherche, 2ème échelon, (csaveanu@pasteur.fr)

BADIS-BREARD Gwenaël, étudiante en thèse

LEBRETON Alice, étudiante en thèse

HANTRAYE Florence, Ingénieur position 1, (fricard@pasteur.fr)

DECOURTY Laurence, Technicienne supérieure de laboratoire, (decourty@pasteur.fr)

Rapports d'activité 2002 - Institut Pasteur
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