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Version PDF      Génétique Moléculaire


  Responsable : Pugsley, Anthony P. (max@pasteur.fr)


  resume

 

Nous étudions les aspects moléculaires de processus fondamentaux chez les bactéries à Gram-négatif : le transport protéique, la biogenèse des membranes et l'activation de la transcription. Comme système modèle, nous étudions la sécrétion de la pullulanase, enzyme amylolytique produit par Klebsiella oxytoca, et la protéine MalT, qui contrôle les gènes impliqués dans le transport et le métabolisme des maltodextrines chez Escherichia coli.



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L'unité de Génétique moléculaire est composée de deux sous-groupes, tous les deux travaillant sur des aspects moléculaires de processus fondamentaux chez les bactéries à Gram-négatif : le transport protéique et la biogenèse des membranes (groupe "Sécrétion") et l'activation de la transcription (groupe "Régulation"). Une partie importante du travail se base sur le système dit "maltose" des enterobacteriaceae. Chez ces bactéries, le transport et le métabolisme de maltodextrines impliquent une série de protéines codées par des gènes situés en trois endroits distincts du chromosome d'Escherichia coli et tous contrôlés par un activateur de transcription spécifique, la protéine MalT. Chez les bactéries du genre Klebsiella, la synthèse et la sécrétion d'une enzyme amylolytique, la pullulanase (une amylase alpha 1-6) dépendent également de la protéine MalT. L'ensemble de ces gènes constitue le régulon maltose. Nous nous intéressons d'une part à la voie de sécrétion de la pullulanase (PulA) et d'autre part aux mécanismes d'activation de la transcription par la protéine MalT.

Groupe " Sécrétion "

La voie de sécrétion de la pullulanase est l'archétype de la voie de sécrétion de type II, dont la machinerie, le sécréton, est composée d'un minimum de 13 protéines. Le rôle du sécréton est de transporter des protéines spécifiques à partir du périplasme (le compartiment entre la membrane plasmique et la membrane externe) à travers la membrane externe. Parmi les composants du sécréton seuls deux sont localisés dans la membrane externe. L'un d'entre eux, la sécrétine PulD, a été purifié et il formerait un tonneau composé de 12 sous-unités et encerclé par 12 molécules de la protéine PulS. Cette dernière, aussi appelée pilotine, est nécessaire à la mise en place de la sécrétine dans la membrane externe et à sa stabilité. Une première structure de ce complexe fut obtenue, il y a quelques années, par cryomicroscopie électronique mais les problèmes techniques qui freinaient l'exploitation de cette technique n'ont été résolus que très récemment par la mise en œuvre d'une nouvelle procédure d'immobilisation du complexe sur une monocouche lipidique (voir figure 1).

Nous avons récemment proposé que certains composants du sécréton qui possèdent des similitudes de séquence, notamment à leur extrémité N-terminale, avec les composants de certains appendices, appelés pili, soient capables de se polymériser pour former, entre les deux membranes, un piston qui propulserait les protéines sécrétées à travers le tonneau formé par la sécrétine. Lorsque le gène codant la sous-unité majeure de ce " pseudopilus " est surexprimé, des pili apparaissent à la surface de la bactérie (voir figure 2). Nous en avons obtenu suffisamment pour permettre une analyse du pseudopilus par microscopie électronique et la purification des sous-unités constitutives du pilus va aboutir à la détermination de leur structure à haute résolution par cristallographie aux rayons X. La combinaison de ces deux approches doit nous permettre de proposer, d'ici peu, un modèle pour la structure et la biogenèse du pseudopilus.

Parmi les autres projets menés dans le Groupe Sécrétion, nous étudions les autres composants du sécréton pour déterminer leurs rôles dans la reconnaissance de la protéine à sécréter ou dans la biogenèse du pilus. D'autre part, nous étudions un autre sécréton, celui d'Escherichia coli, pour mieux comprendre les facteurs qui contrôlent son expression. Enfin, nous nous intéressons aussi aux mécanismes de localisation de lipoprotéines dans l'enveloppe bactérienne.

Groupe " Régulation "

MalT est le représentant, de loin le mieux caractérisé, d'une nouvelle famille d'activateurs transcriptionnels que l'on retrouve chez les bactéries. Par bien des aspects, la protéine MalT (103 kDa) ne ressemble à aucun des régulateurs transcriptionnels modèles étudiés jusqu'alors. L'originalité de ce système de régulation et notre expérience dans l'étude de cette famille émergente de régulateurs transcriptionnels font que nous sommes bien placés pour découvrir de nouveaux paradigmes.

Nous nous concentrons actuellement sur plusieurs aspects originaux du fonctionnement de cette protéine, notamment la multiplicité des contrôles auxquels la protéine est soumise, l'enjeu étant de comprendre comment tous ces signaux régulateurs sont intégrés au niveau de la protéine et modulent son activité. La protéine MalT n'est transcriptionnellement active qu'en la présence simultanée de l'ATP et du maltotriose, les deux effecteurs positifs de la protéine. L'ATP n'a pas de rôle régulateur per se, son rôle en tant qu'effecteur positif étant plus vraisemblablement lié à l'activité ATPase de MalT. MalT est également contrôlée négativement par trois protéines non apparentées, MalK, MalY et Aes. Le contrôle négatif exercé par MalK, composant ABC (ATP-Binding Cassette) du système de transport des maltodextrines, assure le couplage entre l'expression du régulon maltose et le transport des maltodextrines.

Un axe important de notre travail est structural. En effet, la formation d'un complexe transcriptionnellement actif sur un promoteur dépendant de MalT repose sur une série de changements des structures tertiaire et quaternaire de la protéine. MalT semble être en équilibre entre une conformation active et une conformation inactive, la première étant stabilisée par la liaison aux effecteurs positifs (le maltotriose et l'ATP), la deuxième étant favorisée par la fixation des effecteurs négatifs. La transition entre ces deux formes est donc le lieu de la régulation par les effecteurs, et la compréhension au niveau moléculaire de l'intégration de ces signaux passe par la détermination de la structure tridimensionnelle de ces deux formes. L'étape suivante dans la formation du complexe de transcription est la multimérisation de la forme active (voir figure 3), qui favorise très probablement la fixation coopérative de la protéine sur les sites MalT présents dans les promoteurs cibles. Le nombre, les positions et les orientations relatives de ces sites variant suivant les promoteurs, nous devons déterminer quelles propriétés permettent à la protéine de reconnaître ces différentes configurations de sites. Ceci pose entre autre la question du nombre et de l'architecture des formes oligomériques de MalT qui se fixent sur les différents types de promoteurs cibles. Ces approches structurales devraient permettre un saut qualitatif dans la compréhension de l'intégration des signaux par MalT et de leur conversion en une réponse transcriptionnelle appropriée à chaque promoteur.

Figure 1: Cryomicroscopie électronique du complexe PulD-PulS immobilisé sur une couche de lipides porteurs d'un groupement nickel. Les sous-unités présumées de la protéine S (la pilotine) sont numérotées de 1 à 12. L'anneau intérieur est probablement composé de 12 sous-unités de la protéine PulD (la sécrétine). La structure au centre de ce tonneau représente probablement le bouchon qui bloque le canal formé par PulD. (Cliché de Mohamed Chami et Henning Stahlberg, Université de Bâle, Suisse)

Figure 2: Microscopie confocale d'Escherichia coli K-12 exprimant les gènes codant le sécréton de la pullulanase. Les pseudopili sont marqués à l'aide d'anticorps couplés à un fluorophore vert. Les cellules ont été colorées en rouge. Les bactéries " control " ne possèdent pas le gène codant la sous-unité majeure du pseudopilus.

Figure 3: Image en cryomicroscopie électronique des structures multimériques formées par MalT lié à l'ATP et au maltotriose. Image 2D moyennée et schéma d'un élément de ces structures. (Cliché d'Eric Larquet).

Mots-clés: Bactéries, Enterobacteriaceae, sécrétion, membrane externe, maltose, activateur transcriptionnel



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