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Version PDF      Génétique Mycobactérienne


  Responsable : GICQUEL Brigitte (bgicquel@pasteur.fr)


  resume

 

Causée par les mycobactéries du complexe tuberculosis, la tuberculose continue de poser un problème majeur de santé publique: elle est responsable d'environ trois millions de morts par an. Le BCG, seul vaccin disponible actuellement contre cette maladie, est d'une efficacité relative. Quant à l'utilisation des antibiotiques, elle se heurte à l'apparition de souches résistantes. Dans ce contexte, l'Unité de Génétique Mycobactérienne s'intéresse à la caractérisation des facteurs de virulence de M. tuberculosis et aux réponses immunitaires induites par cette bactérie et le BCG. Ces études pourraient conduire à l'identification de cibles thérapeutiques pour de nouveaux agents antituberculeux, et de composants de la bactérie susceptibles d'entrer dans la composition de nouveaux vaccins, voire d'une souche atténuée plus efficace que le BCG. L'unité étudie également la possibilité d'utiliser des souches de BCG portant des gènes étrangers pour protéger contre d'autres maladies, telles que le SIDA. Enfin l'Unité identifie des marqueurs génétiques spécifiques de souches particulièrement épidémiques, en particulier celles qui sont responsables d'épidémies de tuberculose à bacilles multirésistants.



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Etude génétique des déterminants de la virulence (M. Jackson, O. Neyrolles, B. Gicquel)

L'utilisation d'un vecteur thermosensible dérivé du plasmide de Mycobacterium fortuitum pAL5000 et contenant le marqueur de contre-sélection sacB (vecteur Ts/sacB) a permis de construire et d'isoler des mutants d'échange allélique et de transposition chez les mycobactéries du complexe de Mycobacterium tuberculosis. Grâce à l'outil Ts/sacB, une banque ordonnée de 7000 mutants de transposition de M. tuberculosis a été construite et utilisée pour rechercher par différentes techniques de criblage des mutants présentant des insertions dans des gènes définis. Des mutants présentant des insertions dans trois des gènes de M. tuberculosis codant des phospholipases C (plcA, plcB, plcC) ont ainsi été isolés. Un mutant déficient dans la synthèse d'une quatrième phospholipase C (plcD), un triple mutant (plcABC) et un quadruple mutant (plcABCD) ont également été construits par échange allélique. Il a été montré que les quatre enzymes sont actives chez M. tuberculosis et qu'elles catalysent l'hydrolyse de la phosphatidylcholine. L'analyse de la virulence résiduelle de ces mutants dans le modèle murin a révélé que les phospholipases C sont importantes pour la persistence du bacille de la tuberculose chez l'animal.

Une seconde banque de 4000 mutants a été obtenue par la technique de mutagénèse par transposition étiquetée ou "STM" ("signature-tagged transposon mutagenesis"), et criblée pour rechercher directement chez la souris des souches atténuées pour la virulence. Environ 2000 souches ont été criblées pour leur capacité à se multiplier dans les poumons de souris durant la phase aigue de l'infection. Seize mutants atténués ont été sélectionnés et les mutations qu'ils portent ont été caractérisées. Quatre des insertions différentes sont localisées dans un groupe de gènes impliqués dans la biosynthèse et le transport d'un lipide complexe de l'enveloppe de M. tuberculosis: le dimycocérosate de phthiocerol. Le rôle de ce lipide dans la pathogénèse est en cours d'étude plus approfondie dans le laboratoire.

L'intérêt vaccinal des souches atténuées de M. tuberculosis est étudié dans la cadre du "TB vaccine cluster" de la commission européenne coordonné par le Prof. Brigitte Gicquel ( http://www.pasteur.fr/EC_TBvaccine/).

Interactions entre M. tuberculosis et les phagocytes (O. Neyrolles, M. Jackson, B. Gicquel)

Afin de mieux comprendre les mécanismes du parasitisme des macrophages par M. tuberculosis, de nouvelles approches combinées de biologie cellulaire et de génomique fonctionnelle sont en cours de développement au laboratoire. Par ailleurs, nous étudions également les intéractions précoces entre les mycobactéries et les phagocytes humains. Nous avons ainsi montré récemment que M. tuberculosis, et d'autres bactéries du complexe "tuberculosis", utilise la lectine DC-SIGN pour entrer dans les cellules dendritiques humaines, et que le lipoarabinomannane (LAM), un lipoglycane abondant de la paroi mycobactérienne, est un ligand de DC-SIGN (Tailleux et al. (2003)J. Exp. Med. 197, 121-127; Maeda et al. J. Biol. Chem. sous presse).Nous avons également montré que DC-SIGN est exprimé sur les cellules dendritiques pulmonaires humaines et nous avons pu détecter des antigènes mycobactériens dans des cellules dendritiques exprimant DC-SIGN dans des ganglions de patients tuberculeux, indiquant que les mycobactéries intéragissent probablement avec la lectine in vivo. Par ailleurs, nous avons caractérisé les déterminants moléculaires de l'intéraction entre M. tuberculosis et DC-SIGN et nous avons pu ainsi expliquer pourquoi DC-SIGN ne reconnaît que les mycobactéries du complexe "tuberculosis". Ce résultat indique que ces pathogènes ont probablement évolué récemment pour utiliser cette lectine.

Recherche de nouvelles cibles pour des médicaments anti-tuberculeux (M. Jackson, B. Gicquel)

Le phosphatidylinositol (PI) et les produits qui en sont métaboliquement dérivés comme les phosphatidylinositol mannosides (PIM), le lipomannane (LM) et le lipoarabinomannane (LAM) sont des phospholipides/ lipoglycanes qui jouent un rôle important, tant dans la physiologie des mycobactéries que dans leurs intéractions avec l'hôte. La caractérisation des enzymes impliquées dans leur biosynthèse pourrait permettre d'identifier des cibles pour le développement de nouveaux médicaments anti-tuberculeux.

Nous avons identifié chez Mycobacterium tuberculosis un groupe de cinq gènes potentiellement impliqués dans les étapes précoces de la synthèse des PIM. Nous avons analysé la fonction de l'un de ces gènes, pimA (Rv2610c), et montré qu'il code une mannosyltransferase catalysant la synthèse des phosphatidylinositol mono-mannosides. Nous avons développé un essai enzymatique in vitro dans lequel une enzyme PimA recombinante produite chez Escherichia coli catalyse la formation de phosphatidylinositol mono-mannosides à partir de mannose et de phosphatidylinositol. De plus, par le biais de la construction d'un mutant conditionnel thermosensible de Mycobacterium smegmatis déficient dans l'expression du gène pimA, nous avons montré que ce gène est essentiel à la survie de cette bactérie. La synthèse des phosphatidylinositol mono-mannosides et des PIM qui en sont dérivés apparait donc être dépendente de PimA et essentielle à la croissance des mycobactéries. PimA est donc une cible enzymatique intéressante pour le développement de nouveaux anti-tuberculeux. De plus, l'essai enzymatique in vitro que nous avons développé pourra servir de base au criblage à haut-débit d'inhibiteurs de cette enzyme.

Caractérisation fonctionnelle de facteurs de virulence (Jean-Marc Reyrat, Brigitte Gicquel)

L'utilisation de la phosphatase alcaline, de méthode génétique telle la mutagénèse insertionnelle étiquetée, ou bien encore de l'outil informatique ont permis d'identifier un certain nombre de gènes de virulence.

Erp est une protéine secrétee par les bactéries du complexe tuberculosis identifiée grâce à la méthodologie de la phosphatase alcaline. Chez M. tuberculosis, l'inactivation du gène erp par échange allélique a conduit à une atténuation majeure de la virulence aussi bien in vitro, en utilisant des cellules macrophagiques en culture, qu'in vivo dans le modèle murin de la tuberculose. Nous avons montré que Erp est une protéine ubiquitaire des mycobactéries. Cette protéine secrétée est constituée de trois domaines. Le domaine central consiste en une répétition en tandem du motif PGLTS. Cette région centrale est le domaine le plus variable entre espèces : de 4 répétitions dans le cas de M. leprae et jusqu'à 24 pour M. xenopi. Une analyse de la région génomique encadrant le gène erp montre que celui-ci se situe dans une région comprenant principalement des gènes de biosynthèse de la paroi. Grâce à la construction de gène erp hybrides composé d'une régions centrale variable, nous avons montré que la nature de l'allèle exprimé influence d'une part le niveau de colonisation du poumon, l'organe cible de la tuberculose, mais pas celui de la rate. La nature de l'allèle exprimé affecte d'autre part le nombre et la taille des lésions pulmonaires induites par ces souches (de Mendonça-Lima et al. Cell. Microbiol., sous presse).

Un autre aspect du projet concerne la sécrétion chez les mycobactéries. En effet, un certain nombre de facteurs de virulence ou d'antigène sont présents à la surface du bacille ou bien dans le milieu extra-cellulaire. En utilisant la nucléase de Staphylococcus aureus en tant que gène rapporteur, nous avons montré que cette protéine est sécrétée dans le milieu extracellulaire indépendamment de la présence d'une signal-séquence. Des marqueurs cytoplasmiques ont montré que ce phénomène était indépendant de l'autolyse bactérienne. Ces résultats suggèrent l'existence d'une voie de secrétion indépéndante de la voie générale qui reste a être caractérisé.

Un autre locus de virulence potentiel, Mramp, a été étudié en collaboration avec A. Hance de l'Unité 552 INSERM, localisée à l'hôpital Bichat. Mramp est l'orthologue du gène Nramp des mammifères, et est vraisemblablement impliqué dans le transport de cations divalents de part et d'autre de la membrane cytoplasmique bactérienne. Le gène Mramp a été inactivé chez M. tuberculosis et nous avons montré que ce gène procurait un avantage sélectif dans des conditions de culture axénique en carence de fer. En revanche, le gène Mramp ne procure aucun avantage sélectif, que cela soit in vitro en utilisant des lignées macrophagiques murines qu'in vivo dans le modèle murin. Nous avons en outre montré que ce phénotype est indépendant du fond génétique de l'hôte au locus Nramp.

BCG et nouveaux vaccins (Nathalie Winter)

Mycobactérium bovis BCG, bacille vivant atténué, est un vecteur attractif pour le développement de vaccins recombinants. Dans le but d'obtenir des candidats vaccins contre le SIDA, nous avons construit plusieurs souches de BCG recombinant (rBCG) exprimant des antigènes du virus de l'immunodéficience simienne VISmac251 et étudié les réponses immunitaires induites chez le macaque cynomolgus. Ce modèle animal est en effet reconnu pour le SIDA humain. Le mélange rBCG-VIS3 de trois souches de rBCG exprimant les gènes nef, gag (p26) et env de VISmac251 a été inoculé à des groupes de macaques cynomolgus par voie intradermique, la voie classique d'administration du BCG chez l'homme. Une dose rappel a été administrée par voie orale ou rectale. Le vaccin rBCG-SIV3 a induit une réponse de type lymphocyte T cytotoxique dirigée contre les antigènes Gag et Env chez la plupart des animaux. Aucune réponse lymphoproliférative contre les antigènes de VIS n'a été observée durant la phase de vaccination. Après épreuve par voie rectale avec le virus VISmac251 , tous les animaux ont été infectés. Nous avons cependant noté que la vaccination rBCG-VIS3 induisait une réponse mémoire contre les antigènes de VIS.

De nouveaux vecteurs d'expression visant à améliorer la stabilité des souches de rBCG ont été développés. L'utilisation de vecteurs intégratifs a permis d'obtenir des souches de rBCG génétiquement parfaitement stables in vivo, dans le modèle murin. (Méderlé, I. et al. 2002). De nouveaux promoteurs induits dans les cellules présentatrices d'antigènes sont utilisés. Des souches de rBCG sécrétant des antigènes de VIS ont également été obtenues récemment. L'immunogénicité de ces souches chez la souris et le macaque est à l'étude.

Le laboratoire s'intéresse également au rôle des cellules dendritiques dans la réponse immunitaire anti-mycobactérienne. Les cellules dendritiques du derme et les cellules de Langerhans de l'épiderme sont idéalement situées pour initier la réponse immunitaire anti-tuberculeuse après la vaccination BCG qui est administrée par voie intradermique. En collaboration avec plusieurs partenaires (IP et extérieurs), nous étudions le devenir de ces cellules, leur migration vers le ganglion satellite, leur capacité à présenter les antigènes dérivés du BCG et l'implication de certains de leurs récepteurs lectiniques de surface dans l'établissement de la réponse immunitaire au BCG chez la souris.

Epidemiologie moléculaire de la tuberculose (Brigitte Gicquel)

Des marqueurs spécifiques de souches de M. tuberculosis d'avantage transmissibles et responsables d'épidémies, en particulier d'épidémies de tuberculose à bacilles multirésistants aux antibiotiques ont été recherchés en collaboration avec les équipes du réseau européen d'épidémiologie moléculaire de la tuberculose le Public Health Research Institute et les Instituts du réseau et Instituts associés. Des allèles particuliers des gènes de la famille mutT et ogt ont été identifiés chez les souches de génotype Beijing. Ces résultats suggèrent que ces souches particulièrement adaptés à l'hôte ont évolués grâce à l'acquisition de mutations dans des gènes de réparation de l'ADN qui ont conduit à des phénotypes mutateurs vraisemblablement transitoires. Ces allèles spécifiques des souches Beijing peuvent être utilisés pour la mise au point de diagnostic moléculaires (Rad et al. 5th International conference on Pathogenesis of Mycobacterial Infections Stockholm June 27-30 2002). D'une façon générale le typage moléculaire des souches du complexe tuberculosis est effectué dans plusieurs régions pour définir les types majeurs et étudier leurs transmission.

ENSEIGNEMENT

L'Unité est un laboratoire d'accueil du "Marie Curie Host Fellowship" de la Commission Européenne. "Unravellling Mycobacterium pathogenicity. MCFH-1999-00615". http://www.cordis.lu/improving/

RÉSEAUX INTERNATIONAUX

L'unité fait partie des réseaux suivants de la commission européenne :

  1. "A cluster for tuberculosis vaccine development" (N° QLK2-CT-1999-01093). http://www.pasteur.fr/EC_TBvaccine/

  2. "Mucosal Immunization — Cluster Project", (N° QLK2-CT-1999-00228).

  3. "New generation genetic markers and techniques for the epidemiology and control of tuberculosis" (N° QLK2-CT-2000-00630).

  4. "New strategies for treatment and prevention of mycobacterial diseases" (N° QLK2-CT-2000-01761).

  5. "Development of recombinant BCG multivaccine and complementary diagnostics for predominant parasitic and epizootic disease of ruminants in Latin America", (N° ICA4-CT-2000-30032 (INCO-DEV).

  6. "Improved diagnosis, drug resistance detection and control of tuberculosis in Latin America".Projet (N°: ICA4-2000-10054).

  7. "Structural and functional genomics of M. tuberculosis", (N° QLRT-2000-02018).

  8. "TBETHICS", (N° QLK2-CT-2002-30592).

Photo: Trafficking of DC-SIGN (red) and Mycobacterium tuberculosis (green)in a human dendritic cell (DC). Cells and bacteria were incubated 4 h at 4°C (left), 15 min at 37°C (middle) and 3 h at 37°C (right). DC-SIGN is engulfed with the bacillus in the nascent vacuole (middle), then recycled back to the plasma membrane (right).

Mots-clés: Mycobactérie, pathogénicité, virulence, tuberculose, epidémiologie



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  SINNO Helena, secrétaire de direction IP,hsinno@pasteur.fr GICQUEL Brigitte, Professeur, I.P. ;bgicquel@pasteur.fr

FILLON-JACKSON Mary, CR1 I.P.,mjackson@pasteur.fr

NEYROLLES Olivier - CR CNRS,neyrolle@pasteur.fr

REYRAT Jean-Marc, CR 1, INSERM,jmreyrat@pasteur.fr

WINTER Nathalie, CR 2 IP,nwinter@pasteur.fr

ABADIE Valérie, étudiante en thèse (bourse ANRS),vabadie@pasteur.fr

BLAZQUEZ-GOMEZ Jesus, stagiaire post-doctoral (l'Hôpital Ramon y Cajal, Madrid)

BOECHAT Néio - M.D., étudiant en thèse (boursier du gouvernement brésilien),boechat@pasteur.fr

GRELLET Sheyla, étudiante en thèse (bourse du gouvernement brésilien)

KOCINCOVA Dana, étudiante thèse (boursière Marie-Curie)

MAEDA Norihiro, stagiaire postdoctoral (boursier Japan Science & Technology Corporation),nmaeda@pasteur.fr

MARTINEZ Valérie, MD, étudiante en thèse (interne des hôpitaux de Paris)vmartinez@pasteur.fr

MAYA MARQUES Catarina, étudiante en thèse (bourse de la FCT Portugal)

MICK Virginie, étudiante en thèse (CDD I.P.),vmick@pasteur.fr

RECCHI Chiara, étudiante en thèse (bourse FRM ),chiarare@pasteur.fr

ROUSSEAU Cécile, étudiante en thèse (boursière MERT+monitorat Paris 7),rousseau@pasteur.fr

ROSAS MAGALLANES Vania, étudiante en thèse (bourse du gouvernement mexicain),vrosas@pasteur.fr

SONDEN Berit, stagiaire post-doctorale (boursière Marie-Curie),bsonden@pasteur.fr

AUBERT-PIVERT Elisabeth, ingénieur I.P,epivert@pasteur.fr

BADELL-OCANDO Edgar, ingénieur I.P.,ebadell@pasteur.fr

BORDAT Yann, technicien supérieur I.P.,ybordat@pasteur.fr

CHARLES Patricia, agent technique d'exploitation I.P.,pcharles@pasteur.fr

ENSERGUEIX Danielle, technicienne supérieure I.P.,densergu@pasteur.fr

GILLARD Marie-Renée, responsable de préparation I.P.

LALLEMAND Catherine, aide de laboratoire I.P.

RAUZIER Jean, technicien supérieur I.P.,jrauzier@pasteur.fr


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