Portail IP   bandeau_genéral
Version PDF      Génétique et Biochimie du Développement


  Responsable : ROUGEON François (frougeon@pasteur.fr)


  resume

 

L'objectif de nos recherches est d'essayer de comprendre au niveau moléculaire comment les mécanismes qui contribuent à l'évolution et à la stabilité du génome ont été réintégrés sur le plan fonctionnel pour engendrer le répertoire des anticorps. Ainsi, nous étudions quels sont d'une part les liens entre les mécanismes de réparation des cassures double brin et la recombinaison V(D)J responsable de la formation du répertoire primaire des anticorps et d'autre part, les liens entre les phénomènes de recombinaison et de réparation de l'ADN avec ceux impliqués dans la génération du répertoire secondaire (hypermutation). Depuis quelques mois, nous avons mis en place un programme visant à comprendre les mécanismes génétiques impliqués dans la génération du répertoire des anticorps à domaine unique chez les camélidés. Enfin, le programme de recherche sur les médiateurs peptidiques de la glande sous-maxillaire des rongeurs (en particulier, la sialorphine) est aujourd'hui poursuivi dans le groupe animé par Catherine Rougeot, au sein du Département Biochimie Structurale et Chimie.



  rapport

cale

1. Régulation de la recombinaison V(D)J des gènes des immunoglobulines (Michele Goodhardt)

Le réarrangement des gènes des chaînes lourdes et légères des immunoglobulines (Ig) a lieu de manière séquentielle au cours du développement des lymphocytes B. Nos travaux ont mis en évidence deux types d'éléments intervenant dans la régulation du réarrangement : (i) des séquences activatrices associées à l'enhancer intronique k qui induisent le réarrangement ; (ii) des séquences de type silencer situées dans la région intersegmentale Vk-Jk qui confèrent la spécificité du réarrangement, en restreignant la recombinaison des gènes k aux précurseurs des lymphocytes B. Nous avons également montré que l'initiation et l'arrêt de la recombinaison V(D)J aux loci Ig endogènes sont précédés par une réorganisation de la structure chromatinienne : repositionnement des nucléosomes et modification de l'état d'acétylation des histones, de la sensibilité aux nucléases et de l'état de méthylation de l'ADN. Ces modifications semblent jouer un rôle critique dans la régulation de l'accessibilité des gènes des Ig à la machinerie de recombinaison.

2. Régulation de l'expression de la terminale transférase au cours du développement (Noëlle Doyen)

L'addition de régions N aux jonctions formées au cours de la recombinaison entre les segments géniques V(D)J est un processus régulé au cours du développement qui corrèle avec l'expression de la TdT dans les précurseurs lymphocytaires (T et B). Dans le cadre de l'étude des éléments qui contrôlent l'expression du gène de la TdT, nous avons déterminé à quel stade du développement thymique et de la différenciation des cellules T démarrait l'expression du gène de la TdT. Nous avons montré que la TdT est exprimée dès le stade fœtal, à un niveau faible, mais suffisant pour observer la présence de régions N aux jonctions des TCR à la naissance, suggérant qu'il n'y a pas de stricte corrélation entre le niveau d'expression de la TdT et celui de la diversité N. De plus, l'apparition simultanée dans des précurseurs T à différents stades de différenciation indique une influence du microenvironnement thymique sur l'activation du gène de la TdT. Parallèlement, nous avons caractérisé dans le gène de la TdT les sites d'hypersensibilité à la Dnase et recherchons lesquels sont impliqués dans la régulation transcriptionnelle du gène. Bien que la TdT engendre une grande diversité dans les répertoires T et B, elle ne semble pas être à l'origine de différences dans la réponse immunitaire à de nombreux antigènes. Nous avons étudié la réponse à un pathogène (Shigella Flexneri) dans deux modèles de souris transgéniques, l'un dans lequel la diversité N est augmentée au stade fœtal, l'autre dans lequel la diversité est restreinte, puisque le gène de la TdT a été invalidé. De façon inattendue, nous n'avons pas mis en évidence de différence dans la sensibilité et la protection à l'infection. Une analyse plus fine de la réponse montre qu'il existe cependant des différences dans la spécificité des anticorps vis-à-vis de " l'antigène O " qui caractérise le sérotype de la bactérie.

3. Structure et mécanisme d'action de la terminal déoxynucléotidyl transférase (TdT) (Catherine Papanicolaou)

Nous avons montré que les deux isoformes de la TdT murine ont des mécanismes d'action identiques in vitro, alors que seule la forme courte est capable d'additionner des régions N aux jonctions V(D)J des récepteurs B et T, et qu'il n'y a pas d'activité exonucléasique propre à la forme longue. En collaboration avec le groupe de M. Delarue (Unité de Biochimie Structurale), nous avons établi la structure tridimensionnelle du core catalytique de l'isoforme dominante (TdTS) à 2,35 Angströms de résolution. Les données obtenues suggèrent que l'incapacité de la TdT à accommoder un brin d'ADN matrice serait due à un empêchement stérique provoqué par une boucle de dix-huit acides aminés que ne possède pas l'ADN polymérase b réplicative apparentée à la TdT.

4. Réparation des cassures chromosomiques et stabilité du génome (Miria Ricchetti)

L'induction et la réparation des cassures double brin chromosomiques (DSBs) sont d'importance fondamentale pour des procès physiologiques aussi divers que la recombinaison du matériel génétique pendant le méiose ou la diversité des recepteurs immunitaires. Les cassures chromosomiques jouent un rôle crucial dans l'évolution des génomes, par exemple nous avons démontré que la réparation des DSBs est le mécanisme par lequel l'ADN mitochondriale s'intègre dans le génome nucléaire (Ricchetti et al, 1999). Nous avons ainsi analysé la fréquence de ce processus chez l'homme et defini des nouveaux marqueurs pour etudier l'évolution des populations humaines (manuscrit en préparation). Les DSBs n'en presentent pas moins un risque pour la cellule ou l'organisme. Quand le processus de réparation est dérégulé, il peut conduire à la mort cellulaire, à des pathologies variées. Nous avon entrepris d'analyser le potentiel de réparation de cellules normales, en utilisant des souris génétiquement modifiées, dont le génome contient deux sites I-SceI aux deux cotés d'une cassette de sélection (voire collaborations). I-SceI est le site reconnu par endonuclease spécifique qui, une fois exprimée dans la cellule, induit une cassure chromosomique. Puisque la localisation chromosomique de la cassure est connue, nous pouvons analyser précisement la voie de réparation adoptée par la cellule. Nous introduisons cette modification génomique dans des differents types cellulaires murines representant differents stades de la differentiation. Nous utilisons egalement le système I-SceI dans des lignées cellulaire humaines pour analyser le rôle des polymerases mutatrices dans la reparation des cassures double brin.

Mots-clés: terminale transférase, recombinaison V(D)J, structure chromatinienne, régulation de la transcription, réparation de l’ADN



  publications

puce Toutes les publications sur notre base de données


  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  BOUTOUT Laurence, IP, lboutout@pasteur.fr DOYEN Noëlle*, IP, Chef de Laboratoire, E-mail : ndoyen@pasteur.fr

GOODHARDT Michele*, DR2 CNRS, E-mail : migood@pasteur.fr

LAFAYE Pierre, IP, Chargé de Recherche, E-mail : plafaye@pasteur.fr (arrivée le 04/11/02)

LEDUC Mireille, Université Paris XI, Maître de conférence, E-mail : mleduc@pasteur.fr (arrivée le 04/11/02)

PAPANICOLAOU Catherine, CNRS, Chargé de Recherche 1, E-mail : papanico@pasteur.fr

RICCHETTI Miria, IP, Chargé de Recherche, E-mail : mricch@pasteur.fr

ROUGEON François, CNRS/IP, DR1 CNRS, Professeur à l'Institut Pasteur, Chef d’Unité, E-mail : frougeon@pasteur.fr

BONNET Marie, DEA (arrivée le 01/03/03)

BOUBAKOUR Imenne, Thèse, E-mail : imenneb@ pasteur.fr (arrivée le 19/12/02)

CHERRIER Marie*, Thèse, E-mail : cherrier@pasteur.fr

HUAULME Jean-François, Thèse, E-mail : jhuaulme@pasteur.fr

JOVANIC Tihana, Thèse, E-mail : tihana@pasteur.fr (arrivée le 29/10/02)

LE DEZ Gaëlle, CNRS, Technicienne, E-mail : gledez@ pasteur.fr (arrivée le 04/11/02)

MAES Jérôme*, stagiaire post-doctoral, E-mail : jmaes@pasteur.fr

BONNEFOY Géraldine, IP, Technicienne, E-mail : gattal@pasteur.fr

CAVELIER Patricia, CNRS, Technicienne, E-mail : cavelier@pasteur.fr

HERMITTE Véronique, IP, Technicienne, E-mail : hermitte@pasteur.fr

KLIMCZAK Martine*, IP, Technicienne, Technicienne, E-mail : mfanton@pasteur.fr


Rapports d'activité 2002 - Institut Pasteur
filet

Debut de Page recherche Portail Institut Pasteur

En cas de problèmes, de remarques, ou de questions concernant cette page Web écrire à rescom@pasteur.fr