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Version PDF      Cytokines et Inflammation


  Responsable : Cavaillon Jean-Marc (jmcavail@pasteur.fr)


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Nous étudions l'implication des cytokines au cours de processus inflammatoires sévères chez l'homme (sepsis, traumatologie, ischémie-reperfusion, mucoviscidose) et dans des modèles murins. Ces pathologies sont associées à une exacerbation de la production de cytokines et accompagnées d'une immunodépression que nous analysons au niveau de la signalisation intra-cellulaire. Par ailleurs, nous étudions l'influence de l'adhérence sur les propriétés de l'interleukine-10 et la régulation de la production des cytokines par la sérotonine.



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L'unité postulante "Cytokines & inflammation" a été créée le 1er juillet 2001. Les thèmes abordés concernent autant la recherche fondamentale que la recherche biomédicale, cette dernière étant menée en collaboration avec plusieurs services hospitaliers de la région parisienne.

1. BASES MOLÉCULAIRES DE L'IMMUNODÉPRESSSION LORS D'UNE RÉACTION INFLAMMATOIRE SYSTÉMIQUE (M. Adib-Conquy)

Depuis la découverte au laboratoire (Muñoz et al. J. Clin. Invest. 1991, 88, 1747) de l'hyporéactivité des monocytes de sujets sepsis lors d'une réactivation in vitro, nous nous intéressons au processus d'immunodépression associé au sepsis. Nous avons par la suite étendu et précisé ce phénomène au niveau des neutrophiles (Marie et al. Blood 1998, 91, 3439) et des lymphocytes (Muret et al. Shock 2000, 13, 169) de patients sepsis et de patients souffrant d'un syndrome de réponse inflammatoire systémique (SIRS) d'origine non-infectieuse (trauma, ischémie-reperfusion). En collaboration avec le Dr C. Adrie (Hôp. de Saint Denis), le Prof. J-F. Dhainaut (Hôp. Cochin) et les Drs P. Moine et K. Asehnoune (Hôp. du Kremlin Bicêtre), nous avons analysé les mécanismes moléculaires intracellulaires qui président à l'immunodépression observée chez les patients SIRS. Une diminution de la translocation du facteur nucléaire-kB (NF-kB), un déséquilibre entre les formes active (p65p50) et inactive (p50p50), et une très faible expression cytoplasmique de son inhibiteur (IkB) ont été observés chez les patients sepsis(Adib-Conquy et al. Am. J. Respir. Crit Care Med. 2000, 162, 1877). La perturbation de l'expression de NF-kB perdure plus de 10 jours chez des patients traumas (Adib-Conquy et al. J. Leuk. Biol. 2001, 70, 30).

L'immunodépression, évaluée par une forte altération de la production de TNF en réponse au lipopolysaccharide (LPS) des bactéries à Gram négatif, n'est pas un événement universel puisque les cellules demeurent réactives à d'autres stimuli (Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes) et continuent à produire de l'interleukine-10 (IL-10) et de l'IL-1 receptor antagonist (IL-1ra) en réponse au LPS. Nous avons montré que l'expression normale des Toll-like receptors (TLR)-2 et réduite des TLR4 ne pouvait pas à elle seule expliquer l'altération de la signalisation observée dans les cellules de sujets SIRS. Contrairement à la voie TLR4, la voie TLR2 aboutissant à la production de TNF ne semble pas altérée. Par contre, la signalisation via TLR4 aboutissant à la production d'IL-10 (activation de la p38 MAPK et du facteur de transcription Sp-1) est amplifiée dans les cellules de sujets SIRS (figure). Ce travail démontre que l'hyporéactivité leucocytaire n'est pas un phénomène universel, mais qu'elle dépend des voies d'activation utilisées, certaines pouvant être altérées, tandis que d'autres demeurent fonctionnelles, voire surexprimées.

2. STATUT IMMUNOLOGIQUE DE PATIENTS APRÈS UN ARRÊT CARDIAQUE ET RÉANIMATION(M. Adib-Conquy, C. Fitting)

En collaboration avec le Dr. C. Adrie (Hôp. de St Denis), nous avons étudié des patients réanimés après un arrêt cardiaque (ACR). Cette situation clinique peut être considérée comme les suites d'un phénomène d'ischémie-reperfusion systémique. Nous avons démontré la présence d'endotoxine dans le plasma de 46% des patients (n = 35) au cours des deux premiers jours qui suivent leur admission. Nous avons montré dès l'admission (environ 3 heures après l'arrêt cardiaque), des taux plasmatiques élevés de sTNFRII, d'IL-6, d'IL-8 et d'IL-10, significativement plus importants chez les patients qui vont décéder que chez les sujets survivants. Lors de cultures en sang total en présence de différents activateurs, nous avons trouvé que les leucocytes des patients ACR sont déactivés de manière similaire à ceux des patients sepsis. L'ensemble de ces résultats démontre que le choc hémodynamique en absence de toute infection est suffisant pour induire un état d'immunodépression qui présente des caractéristiques communes avec celui observé lors du syndrome septique (Adrie et al. Circulation 2002, 106, 562).

3- CYTOKINES ET MUCOVISCIDOSE (M. Adib-Conquy, A-F. Petit-Bertron, C. Fitting)

En collaboration avec les Drs H. Corvol et A. Clément (Hôp. Trousseau), il a été montré que les neutrophiles isolés de liquide d'expectoration d'enfants souffrant de mucoviscidose présentaient une production spontanée ex vivo très élevée d'IL-8. Celle-ci ne peut être accrue par le LPS ni inhibée par la dexamethasone contrairement à ce qui est observé avec les neutrophiles circulants. L'étude actuelle porte sur l'expression des molécules TLR2 & TLR4 et sur l'activité de l'interleukine-10 sur ces neutrophiles (Ces travaux sont financés par l'Association "Vaincre la Mucoviscidose"). D'autres études portent sur les conséquences de l'interaction de cellules épithéliales glandulaires pulmonaires et de neutrophiles circulants de sujets mucoviscidosiques ou non (collaboration avec les Drs J. Jacquot et O. Tabary).

4- PRODUCTION DE MIF (V. Maxime, C. Fitting)

Le "macrophage migration inhibitory factor" (MIF) est une cytokine inflammatoire qui s'oppose aux effets des glucocorticoïdes. En collaboration avec le Prof. D. Annane (Hôp. R. Poincaré, Garches), nous avons analysé chez les patients sepsis les taux de MIF plasmatique et montré que ceux-ci corrélaient (r = 0.62, p = 0.001) avec le déficit en glucocorticoïde, défini par la valeur delta max obtenue par l'analyse de l'augmentation maximale de cortisolémie après ACTH. Nous étudions également l'induction de MIF in vitro au niveau de leucocytes sanguins de sujets normaux et des patients sepsis au cours du traitement par les glucocorticoïdes, en réponse à différents activateurs. Ce travail est poursuivi en collaboration avec C. Behr et Ph. Boeuf (Unité d'immunologie moléculaire des parasites, IP) pour ce qui concerne l'expression des ARNm du MIF, analysés par RT PCR quantitative.

5- SIGNALISATION VIA LES VOIES TOLL-LIKE RECEPTORS et NOD1 (M. Adib-Conquy, C. Fitting)

Dans le cadre du programme transversal de recherche (PTR 94) coordonné par Catherine Werts (Unité de Bactériologie Moléculaire et Médicale), nous cherchons à caractériser l'implication des molécules TLR2, TLR4, TLR9 et Nod1 dans l'induction des voies de signalisation qui mènent à des productions différentielles de TNF ou d'IL-10. Pour se faire, de nombreux ligands (pathogens associated molecular patterns, PAMPs) sont utilisés sur des macrophages de souris invalidées pour ces différentes molécules.

6- MÉCANISMES MOLÉCULAIRES ASSOCIÉS À LA LEVÉE DE LA TOLÉRANCE AUX ENDOTOXINES PAR L'INTERFERON-g ET LE GM-CSF (M. Adib-Conquy)

L'hyporéactivité leucocytaire observée chez des patients SIRS peut être mimée in vitro, en prétraitant pendant 24 heures des monocytes humains avec du LPS, avant de les stimuler de nouveau avec le même activateur. Ce phénomène est appelé tolérance aux endotoxines. La tolérance aux endotoxines peut être prévenue in vitro et in vivo par des cytokines immunostimulantes telles que l'interféron gamma (IFNg) ou le "granulocyte monocyte-colony stimulating factor" (GM-CSF). Nous avons montré que l'effet amplificateur de l'IFNg et du GM-CSF sur la production de TNF par les monocytes, ainsi que leur capacité à lever la tolérance à l'endotoxine ne sont pas dus à une modulation de TLR4 ou MD-2. Nous avons montré que l'IFNg et le GM-CSF induisent une augmentation de l'expression d'IRAK dans les monocytes. Dans les cellules tolérantes au LPS, au contraire, IRAK est peu exprimé. L'IFNg et le GM-CSF permettent de rétablir l'expression d'IRAK dans les monocytes tolérisés par une faible dose de LPS, mais pas avec une forte dose. L'activation d'IRAK et son association à MyD88 sont également favorisées par l'IFNg et le GM-CSF. Ces cytokines permettent donc, dans le cas d'une tolérance induite par une faible concentration de LPS, de rétablir dans les monocytes l'activation d'IRAK, son association avec MyD88, l'activation de NF-kB en réponse au LPS, et en final la production de TNF (Adib-Conquy & Cavaillon, J. Biol. Chem. 2002, 277: 27927).

7- COMPARTIMENTALISATION LORS DU PHÉNOMÈNE DE TOLÉRANCE AUX ENDOTOXINES (C. Fitting)

Après une injection de LPS chez la souris, les cellules acquièrent un état de tolérance au LPS dont l'amplitude et la durée dépendent du compartiment tissulaire dont elles sont issues (rate, moelle osseuse, péritoine, poumon, sang périphérique). Le phénomène n'est que très partiellement dépendant de l'induction de glucocorticoïdes comme l'ont démontré des expériences avec des souris surénalectomisées, l'injection de dexamethasone ou l'usage d'un antagoniste des glucocorticoïdes (RU486).

8- MODULATION PAR L'ADHÉRENCE DES PROPRIÉTÉS DE L'INTERLEUKINE-10 (M. Adib-Conquy, A-F. Petit-Bertron)

L'adhérence des monocytes influence les propriétés de l'IL-10. Nous avons observé qu'en réponse à une stimulation ultérieure par le LPS, des monocytes prétraités avec de l'IL-10 dans des conditions de non-adhérence produisaient davantage de TNF alors que dans des conditions d'adhérence l'IL-10 inhibe cette production. Cet effet paradoxal est retrouvé au niveau de l'ARNm du TNF et du facteur de transcription NF-kB (Adib-Conquy et al. Intern. Immunol. 1999, 11, 689). L'adhérence n'a pas d'effet majeur sur la modulation des marqueurs de surface, que ceux-ci soient impliqués dans la signalisation initiée par le LPS (CD14, TLR4, MD2) ou par l'IL-10 (IL-10R), dans les phénomènes d'adhérence (CD11a, CD62L), dans la co-activation (CD40) ou la présentation de l'antigène (HLA DR). Seule l'expression de CD11b est plus fortement inhibée par l'IL-10 en présence d'adhérence. L'effet amplificateur de l'IL-10 sur la phagocytose est nettement plus marqué lorsque les monocytes sont maintenus dans des conditions non-adhérentes. Enfin, les cinétiques d'activation de STAT-3, tyk2 et d'induction de SOCS3 et de l'hème oxygenase-1, en réponse à l'IL-10 sont influencées par l'existence de l'adhérence leucocytaire (Petit-Bertron et al. J. Leuk. Biol. 2003, 73, 145). Nous pensons que notre modèle in vitro peut mimer certaines situations in vivo. L'étude se poursuit en collaboration avec T. Pédron (Unité de pathogénie microbienne moléculaire) pour une analyse par puces ADN du profil des ARNm modulés par l'adhérence et l'IL-10.

9- SÉROTONINE ET PRODUCTION DE CYTOKINES (I. Cloëz-Tayarani)

La sérotonine (5-hydroxytryptamine = 5-HT) est libérée par les plaquettes activées et peut se trouver à des concentrations micromolaires aux sites d'inflammation. Nous avons étudié l'effet de la 5-HT sur la production de cytokines par les cellules périphériques mononucléées (PBMC) humaines activées par le LPS, et sur la régulation de l'expression de leurs gènes. La 5-HT régule de façon différentielle la production de cytokines : elle inhibe significativement et de façon dose-dépendante la production de TNF tandis qu'elle augmente à plus fortes doses celle d'IL-1b. Par contre, dans les mêmes conditions expérimentales, les productions d'IL-1a, d'IL-6, d'IL-10 et d'IL-1ra demeurent inchangées. De même, la présence de caspase-1 n'est pas augmentée et ne peut donc rendre compte de l'augmentation d'IL-1b observée. La modulation est post-transcriptionelle puisque les taux des ARNm de TNF et d'IL-1b ne sont pas modifiés. L'effet inhibiteur de la 5HT est réversé par un antagoniste sélectif du récepteur 5HT2A (kétansérine) et mimé par un agoniste sélectif des récepteurs 5HT2A/2C (DOI). Ces résultats qui suggèrent l'implication du récepteur 5HT2A dans les effets de la sérotonine, est confirmée par l'identification par Western blot de ce récepteur au niveau des PBMC. Ces résultats suggèrent l'implication de la sérotonine dans la modulation des processus inflammatoire et la production de cytokines (Cloëz-Tayarani et al. Intern. Immunol. 2003, 15, Feb. issue).

Illustration schématique des voies de signalisation altérée (sur fond gris) ou amplifiée (trait épais) dans les leucocytes de patients trauma aboutissant à la production de TNF, d'IL-1b, d'IL-1ra et d'IL-10 en réponse aux activations par les ligands de TLR2 ou de TLR4. Ce schéma tient compte de nos travaux en cours et publiés (Adib-Conquy M et al J. Leuk. Biol. 2001; 70:30) ainsi que des travaux rapportés dans la littérature (Learn et al. J. Biol. Chem. 2001; 276:20234 ; Solomon et al. J. Clin. Invest. 1998; 102:2019)

Mots-clés: Toll-like receptor, sepsis, signalisation intra-cellulaire, endotoxine, sérotonine



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
    Minou Adib-Conquy Chargée de recherche IP ,madib@pasteur.fr

Isabelle Cloëz-Tayarani Chargée de recherche IP ,icloez@pasteur.fr

Anne-France Petit-Bertron Etudiante en Thèse ,afpetit@pasteur.fr

Virginie Maxime Etudiante en DEA , virginie.maxime@libertysurf.fr

Shaw Warren Professeur invité , warren@helix.mgh.harvard.edu

Catherine Fitting Technicienne IP , cfitting@pasteur.fr

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