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Version PDF      Cryomicroscopie moléculaire


  Responsable : Gérard Pehau-Arnaudet (gpehau@pasteur.fr)


  resume

 

Crée en Avril 2002, la Plate-forme de cryomicrocopie moléculaire a pour vocation de mettre à disposition du campus Pasteurien un outil moderne de la biologie structurale, la cryomicroscopie électronique. Complétant d'autres approches (Rayons X, RMN), la cryomicroscopie repose sur l'observation d'objets biologiques hydratés et congelés. Couplée à des techniques d'analyses d'images, elle permet d'obtenir des informations structurales à moyenne résolution (généralement entre 7 et 30 Å). Actuellement, nous développons au laboratoire deux thématiques principales : l'une porte sur l'analyse d'une couche S de Bacillus anthracis par cristallographie électronique (collaboration avec l'équipe de M.Mock). Cette approche consiste à reconstituer in vitro la couche S, puis à en déterminer la structure. L'autre, (collaboration avec l'équipe de K.M.Kean) concerne la validation d'un modèle de circularisation de l'ARN messager viral rendant l'initiation de la traduction plus efficace. Cette étude est menée sur l'ARN du virus de l'hépatite C (HCV). Enfin l'implantation en Décembre 2001 d'un cryomicroscope à émission de champ (Jeol 2010F), nous conduit à accueillir des équipes extérieures au campus désireuses de mener des études structurales à haute/moyenne résolution.



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Crée en Avril 2002, la plate-forme de cryomicroscopie moléculaire a pour vocation de mettre en œuvre les techniques de la microscopie électronique dans le champ de la biologie structurale, en complément des approches classiques (RMN, Rayons X) déjà présentes sur le campus Pasteurien. Depuis le début des années quatre-vingt, la cryomicroscopie s'est imposée comme une technique de choix en biologie structurale. Cette méthodologie repose sur la congélation d'objets biologiques dans leur état hydraté, à une vitesse empêchant toute formation de glace cubique ou hexagonale. Les échantillons sont inclus dans un film de glace vitreuse, observés à une température voisine de -180°C sous de très faibles doses d'électrons (<10 électrons/Å2). Les données structurales sont ensuite extraites, en utilisant différents programmes informatiques. Une des caractéristique de la cryo-microscopie est qu'elle s'intéresse à de nombreux objets biologiques: les protéines (PM ≥ 300 kDa), les cristaux bidimensionnels de protéines (PM ≥ 30 kDa), les virus, l'ADN, l'ARN …

Au laboratoire nous développons actuellement deux thématiques principales :

1-Etude par Cristallographie Electronique d'une des Couche S de Bacillus anthracisXavier Hagnerelle, Gérard Pehau Arnaudet, Agnès Fouet et Pedro Alzari

Les couches S sont des composants de la surface de l'enveloppe cellulaire d'organismes procaryotes, formant des réseaux cristallins bidimensionnels de nature protéique (1). Chez Bacillus anthracis, les couches S sont constituées de deux protéines de 94 kDa chacune : Sap (pour Surface array protein) et EA1 (pour Extractable Antigen 1). Ces deux protéines forment chacune un réseau cristallin en fonction du stade de croissance bactérienne (2, 3). Des travaux récents ont montré que ces deux protéines sont des répresseurs transcriptionnels du gène eag (codant la protéine EA1)(2).

Au laboratoire, nous étudions la structure de la protéine Sap et son organisation au sein de la couche S, afin de compléter les données génétiques et biochimiques par une approche de biologie structurale. Pour cela nous avons mis en place les méthodes de formation des cristaux bidimensionnels sur film lipidique (4), afin de reconstituer in vitro, un réseau identique à celui observé à la surface de la bactérie. Cette approche nous a déjà permis de construire une carte de projection du réseau à 15 Å de résolution. Actuellement nous essayons d'améliorer la qualité de nos cristaux afin d'enregistrer des informations structurales à plus haute résolution. En parallèle, nous avons surexprimé une protéine Sap recombinante et effectuons des expériences de cristallisation tridimensionnelles pour permettre des études cristallographiques par rayons X.

(1)   U. B. Sleytr, P. Messner, D. Pum, and M. Sara. Crystalline Bacterial Cell Surface Layers. Springer Verlag Berlin Heidelberg, 1988.

(2)   T. Mignot, S. Mesnage, E. Couture-Tosi, M. Mock; A. Fouet.  Molecular Microbiology,  43(6), 1615-1627, 2002. 

(3)   E. Couture-Tosi, H. Delacroix, T. Mignot, S. Mesnage, M. Chami, A. Fouet  and G. Mosser, Journal of Bacteriology, 6448-6456, 2002

(4)   E. E. Uzgiris, R. D. Kornberg, Nature, 301(5896),125-129, 1983.

Carte de projection du réseau de la protéine Sap. Cette carte est calculée à 15 Å de résolution.

Paramètres de maille : a = 200 A, b = 86 Å, angle = 96° En encart : représentation d'un pattern de diffraction, le premier cercle correspond à 1/17Å

2-Mécanisme de la circularisation des ARN messagers viraux non coiffés et/ou polyadenylés : une cible potentielle pour une stratégie anti-virale de spectre large ?Gérard Pehau-Arnaudet, Sylvie Paulous, Katherine M. Kean

Dans les cellules eucaryotes, l'initiation efficace de la traduction des ARNm cellulaires nécessite une interaction fonctionnelle entre la coiffe en 5' et la queue poly(A) en 3', par le biais d'interactions entre des protéines qui fixent ces extrémités de l'ARN (eIF4E et PABP respectivement, liés tout les deux à l'eIF4G) et permettent de circulariser physiquement les ARNm cellulaires.(1)(2)(3)(4)

Ce rôle de l'interaction entre les extrémités 3' et 5' via des RNP et donc de la circularisation des ARN messagers dans l'initiation efficace de la traduction, serait partagé par beaucoup de pathogènes des eucaryotes en particulier par des virus. L'équipe de K. M. Kean a développé un certain nombre de modèles qui permettent de travailler sur la traduction des ARN viraux. Le génome de l'hépatite C, qui ne comporte pas de coiffe en 5', ni de queue poly A en 3' a été choisi. Deux raisons ont guidé ce choix, d'une part l'importance de ce virus en terme de santé publique, d'autre part le caractère au premier abord simple, de ce modèle. Ce groupe a établit sur des lysats de réticulocytes de lapin traités a la nucléase et débarrassés de la plupart de leurs ribosomes, qu'il existait une " communication " entre l'extrémité 5' porteur d'une IRES et une région située à l'extrémité 3' du génome.

Nous nous attacherons à mettre au point les conditions de visualisation par microscopie électronique des complexes RNP-ARN afin de valider ou d'invalider le modèle de circularisation.

(1) Gallie DR., Genes & DEv., (1991), 5, 2108-21016.

(2) Hentze M. W., Science, (1997), 275, 500-501.

(3) Imataka H., Gradi A., Sonenberg N., EMBO J., (1998), 17, 7480-7489.

(4) Wells SE., Hillner PE., Vale RD., Sachs AB., Molecular Cell., (1998), 2, 135-140.

En Décembre 2001, grâce à un cofinancement Institut Pasteur, CNRS, Région Ile de France, était implanté au sein de la plate-forme de cryomicroscopie moléculaire un microscope électronique Jeol de 200kV à canon à émission de champ, totalement équipé et dédié à la cryomicroscopie à haute résolution. L'implantation de ce cryomicroscope est née de la volonté d'un certain nombre de laboratoires français issus du GDR 2368 de se doter d'un équipement de pointe. L'année 2002, a permis l'optimisation de cet instrument qui, à l'automne 2002, après l'aval d'un comité de programme CNRS/Pasteur présidé par F.Livolant, a été ouvert à l'ensemble de la communauté des laboratoires regroupés dans ce projet fédératif et plus généralement à l'ensemble de la communauté des cryomicroscopistes français.

Photo 1: Carte de projection du réseau de la protéine Sap. Cette carte est calculée à 15 Å de résolution.Paramètres de maille : a = 200 A, b = 86 Å, angle = 96° En encart : représentation d'un pattern de diffraction, le premier cercle correspond à 1/17Å

Photo 2: Jeol 2010F : cryomicroscope à émission de champ, 200kV.

Mots-clés: cryomicroscopie, microscopie électronique, biologie structurale, protéine Sap, initiation de la traduction, HCV



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        Gérard Pehau-Arnaudet, IE2, CNRS,gpehau@pasteur.fr

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