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Version PDF      Chimie Organique


  Responsable : Huynh-Dinh Tam (hdt@pasteur.fr)


  resume

 

Les travaux de l'Unité de Chimie Organique concernent la synthèse et l'étude de trois classes importantes de composés biologiques : nucléosides ou nucléotides, peptides et sucres. L'accès à ces molécules permet de déterminer leurs structures et leurs interactions, en vue de la mise au point de vaccins synthétiques ou d'inhibiteurs d'enzymes, en collaboration avec d'autres unités pasteuriennes. Deux groupes de l'Unité ont développé un programme de sélection in vivo et d'évolution dirigée in vitro d'enzymes.



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Synthèse peptidique (Françoise Baleux)

Depuis plusieurs années, notre groupe peptide s'est spécialisé dans la synthèse de longs peptides (50-70 AAs) et de peptides modifiés, ceci dans le cadre de collaborations avec des équipes pasteuriennes ou extérieures.

Chimiokines/HIV

Les chimiokines SDF-1 et Mip-1/RANTES sont capables d'inhiber l'entrée du virus HIV dans les cellules CD4+ via les co-récepteurs CXCR4/CCR5. Ces mini-protéines de 70 AAs sont accessibles à la synthèse chimique qui permet de plus d'introduire sélectivement des marqueurs (fluorochromes, biotine) sur des AAs qui ne participent pas à l'activité biologique des chimiokines, générant ainsi des protéines marquées entièrement fonctionnelles.

Nous avons mis en évidence que l'Elastase régule négativement le binding et l'activité inhibitrice du couple SDF/CXCR4 en clivant la partie N-terminale de SDF et de CXCR4. La modification chimique de la liaison peptidique cible de l'Elastase au sein de SDF génère une chimiokine resistante à cette dégradation, maintenant ainsi sa capacité inhibitrice.

Structure, repliement de peptides et interaction avec les membranes

*L'analyse par RMN des principaux éléments structuraux du domaine globulaire de la protéine Prion murine montre que hormis l'hélice I, ces éléments forment des fibres comportant majoritairement des structures en feuillet .

*PMP1 est une petite protéine membranaire de Saccharomyces Cerevisiae régulant l'activité de l'H+ ATPase. Malgré son caractère très hydrophobe, nous avons réalisé la synthèse de PMP1 qui a été choisie comme modèle pour explorer les mécanismes moléculaires impliqués dans l'interaction lipides/protéine. L'analyse par RMN en présence de micelles de DPC/POPS a permis de suivre l'association phospholipides/protéine, mettant en évidence l'insertion préférentielle de la chaîne lipidique sn-2 dans le sillon de l'hélice C-ter de PMP1, provoquant ainsi le clustering des molécules de POPS.

Epitopes glycosylés secrétés par Mycobacterium tuberculosis (Françoise Baleux/Laurence Mulard)

Des données récentes suggèrent que certaines protéines mannosylées sécrétées par la bactérie sont des antigènes immunodominants lors des infections par M. tuberculosis. Des épitopes majeurs de nature glycopeptidique leurs seraient associés. L'approche biochimique, menée sur la protéine Apa, a permis de proposer les séquences en acides aminés associées à plusieurs de ces cibles potentielles, sans toutefois révéler leurs glycoformes. Mettant à profit la flexibilité de la synthèse peptidique sur phase solide et celle de la glycochimie, une panoplie de peptides diversement mannosylés ont été synthétisés. Leur évaluation a permis la détermination de l'un des épitopes immunodominants portés par la protéine Apa.

Polysaccharides bactériens et développement de vaccins synthétiques chimiquement définis (Laurence Mulard/Françoise Baleux)

Le rôle clé des polysaccharides de surface bactérienne comme cibles majeures de la réponse immunitaire protectrice de l'hôte en réponse à une infection est maintenant bien établi. Fondé sur la notion d'épitopes osidiques " protecteurs " et dérivé du concept de l'haptène, le développement d'immunogènes synthétiques offre une alternative aux vaccins conjugués " polysaccharides:protéines " conventionnels. Inscrit dans cette thématique, notre but est de développer des constructions chimiquement définies, présentant de façon multivalente une combinaison d'épitopes saccharidiques reconnus par des anticorps protecteurs (épitopes B) et d'épitopes T appropriés à l'induction d'une réponse mémoire. Shigella flexneri, responsable d'une forme sévère de dysenterie, est utilisée comme modèle pour démontrer le potentiel de l'approche glycoconjugués synthétiques dans le domaine des vaccins multivalents.

L'approche en cours d'étude implique une bonne connaissance de la spécificité de la réponse immunitaire de l'hôte en réponse à l'infection. Dans ce but, une panoplie d'oligosaccharides complexes, représentatifs de fragments des polysaccharides de surface de S. flexneri sérotypes 2a et 5a, ont été synthétisés. L'étude de leur interaction avec des anticorps monoclonaux protecteurs a permis de caractériser les éléments clés de la reconnaissance. Sélectionnés sur la base de cette approche rationnelle, des oligosaccharides représentatifs du polysaccharide de surface de S. flexneri 2a ont été synthétisés sous une forme permettant leur dérivatisation sélective. La stratégie de construction des glycoconjugués mise en place repose sur une approche modulaire, donc extrêmement flexible. Elle a été validée sur les haptènes courts. L'évaluation de l'immunogénicité des glycopeptides synthétisés est en cours.

Synthèse d'analogues de nucléosides et nucléotides comme antiviraux potentiels (Laurence Mulard)

Les nucléosides -boranophosphate apparaissent comme de bons candidats pour le développement d'antiviraux actifs contre les souches résistantes de HIV. Nous avons entrepris, sur le modèle d4T, de synthétiser différents modèles de " pro-drogues " susceptibles de pallier au problème du passage transmembranaire de ces analogues chargés. La synthèse d'un certains nombres d'analogues en série AZT a permis d'étudier la stabilité de la fonction -boranophosphate tant dans les milieux cellulaires que dans différentes conditions de pH.

Glycopeptides synthétiques à potentiel vaccinal anti-tumoral (Sylvie Bay)

S'appuyant sur une approche rationnelle et spécifique de l'immunothérapie anti-tumorale, notre programme de recherche vise à développer des vaccins synthétiques basés sur des marqueurs tumoraux saccharidiques. Nous avons ainsi mis au point un nouveau type d'immunogène : le MAG ou Multiple Antigenic Glycopeptide qui présente l'épitope saccharidique d'intérêt (i.e. le marqueur tumoral) de façon multivalente en association avec un épitope T CD4+ peptidique. Le caractère synthétique des MAG constitue un avantage de sécurité essentiel en vue de leur utilisation in vivo.

L'ensemble de nos résultats (collaboration avec R. Lo-Man et C. Leclerc, Institut Pasteur) montre que le MAG est une stratégie efficace pour générer des taux élevés d'anticorps spécifiques du marqueur saccharidique et pour prolonger la survie de souris porteuses de tumeur, après vaccination thérapeutique ou prophylactique.

Nous avons également préparé une nouvelle génération de composés potentiellement utilisables chez l'homme, en introduisant des épitopes T CD4+ "universels" au sein des structures. Les premiers composés sont très immunogènes chez le singe ainsi que chez des souris transgéniques pour les molécules HLA.

Une autre partie de notre programme consiste à synthétiser des glycopeptides pour induire des réponses T cytotoxiques spécifiques.

Glycoconjugués porteurs de phosphorylcholine pour le développement de thérapies anti-bactériennes (Sylvie Bay)

L'objectif est de développer une nouvelle approche thérapeutique, basée sur l'utilisation d'anticorps, pour combattre certaines infections bactériennes du tractus respiratoire (Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis). Dans ce but, nous avons synthétisé un mime d'un antigène naturel ubiquitaire exprimé à la surface des bactéries, la phosphorylcholine glycosylée, synthon à partir duquel nous avons préparé des conjugués protéiques ainsi qu'un dérivé biotinylé. Ces réactifs seront utilisés pour générer des anticorps à visées thérapeutique et/ou diagnostique.

Synthèse et réactivité biologique de nucléosides hétérodoxes (Alexandre Kaminski / Sylvie Pochet)

Notre activité de recherche vise à élargir la gamme des acides nucléiques qui peuvent être répliquées in vitro ou in vivo. Nous avons développé un procédé combinatoire de synthèse permettant d'engendrer une vaste collection de nucléosides triphosphates pour les soumettre à des tests d'incorporation par des ADN polymérases et cribler des monomères doués de capacité d'appariement univoque ou ambiguë et/ou des inhibiteurs de réplication. Parallèlement à l'altération de la partie hétérocyclique du nucléoside, une deuxième modification concernant le squelette phosphopentose a été abordée. Nous avons montré que des mimes d'acides nucléiques où l'ose est constitué d'un cycle à six atomes (Hexitol Nucleic Acid) sont reconnus par les ADN polymérases et peuvent transferer l'information génétique in vivo.

Afin d'accéder à une plus grande diversité d'analogues nucléosidiques déviant par la base ou par le sucre, nous avons isolé des gènes codant pour une activité N-désoxyribosyltransférase de différentes souches de lactobacilles. Disposant d'une variété d'enzymes, nous pourrons élargir leur spécificité par des mutations dans les gènes sauvages ou par des chimères de ces gènes sauvages. Le premier criblage de mutants nous a permis de sélectionner in vivo dans une souche d'E. coli auxotrophe pour l'uracile une N-didésoxyribosyltransférase.

Le groupe participe également à la conception d'inhibiteurs de nucléoside monophosphate kinases (TMPK et UMPK) de M. tuberculosis, enzymes essentielles à la croissance de la bactérie. L'approche retenue est la conception rationnelle de drogues à partir de la structure tridimensionnelle des cibles, puis la synthèse et la détermination du pouvoir inhibiteur des différents composés synthétisés tout d'abord in vitro sur la protéine purifiée, puis in vivo sur des cultures de M. tuberculosis. La caractérisation de la thymidylate kinase (TMPK) de M. tuberculosis a mis en évidence des propriétés catalytique et structurale nouvelles, faisant de cette protéine la première cible pour la recherche d'antituberculeux.

Evolution dirigée d'enzymes (Sophie Vichier-Guerre/Jean-Luc Jestin)

Dans le groupe d'évolution dirigée des enzymes, nous développons une Chimie des Inovirus pour isoler des catalyseurs à partir de répertoires de plus de 108 protéines. L'objectif consiste à obtenir des catalyseurs sur mesure.

La sélection in vitro en fonction de l'activité catalytique est une sélection en fonction de l'affinité pour le produit, qui est ponté à la phage-enzyme qui a catalysé la réaction de substrat à produit. Les enzymes sont exprimées à la surface de phages pour établir un lien entre le génotype qui est amplifiable, et le phénotype, c'est-à-dire l'activité catalytique recherchée de la protéine.

Les résultats remarquables sont : (i) l'isolement d'un catalyseur à partir de plus de 108 autres protéines (ii) la généralisation de cette sélection in vitro, désormais démontrée pour des réactions de clivage de subtrat tout comme pour des réactions de synthèse (iii) la généralisation de la sélection in vitro à différents systèmes d'expression de protéines à la surface de phages pour des applications en protéomique (iv) des facteurs d'enrichissements de plus de 104 par cycle, les plus élevés décrits pour des sélections en fonction de l'activité catalytique, quelque soit la stratégie utilisée pour relier phénotype et génotype.

Cette stratégie d'évolution dirigée d'enzymes a des applications en ingénierie des enzymes et en chimie thérapeutique, tout comme en génomique fonctionnelle pour la mise en évidence de cibles thérapeutiques.

Oligonucléotides (Tam Huynh-Dinh)

Nous avons particulièrement développé la synthèse ex-situ de puces à ADN en collaboration avec différents laboratoires extérieurs. L'objectif est d'obtenir des puces fiables, donnant des résultats reproductibles et d'un moindre coût. Des méthodes de greffage par liaison covalente hydrazone en 5' et 3' ont été développées.

D'autres travaux ont porté sur la conformation d'oligonucléotides (double hélice avec des liaisons Hoogsteen, boucles ARN, triple hélices), les interactions acides nucléiques-protéines (complexe de dimérization-nucléocapside) et la synthèse d'ARNi pour le contrôle de l'expression de gènes de HIV.

Mots-clés: vaccins synthétiques, chimiokines, nucléosides hétérodoxes, sélection in vivo d'enzymes, évolution in vitro, oligonucléotides



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Garnier Marie-ange (mag@pasteur.fr) Baleux Françoise, IP (CR,baleux@pasteur.fr)

Bay Sylvie, IP (CR,sbay@pasteur.fr)

Huynh-Dinh Tam, CNRS (DR1,hdt@pasteur.fr)

Jestin Jean-Luc, IP (Assistant,jjestin@pasteur.fr)

Kaminski Pierre-Alexandre, IP (CR,akaminsk@pasteur.fr)

Mulard Laurence, IP (CR,lmulard@pasteur.fr)

Pochet Sylvie, CNRS (CR1,spochet@pasteur.fr)

Vichier-Guerre Sophie, CNRS (CR2,svichier@pasteur.fr)

Bélot Frédéric, Post-doc

Bousserouel Hadjira, DEA

Cadena Amaro Claudio, Thèse

Cocoletzi Avila Brenda, DEA

Perrier Sandrine, Thèse

Strobel Heike, Post-doc

Coïc Yves-Marie, IP (Ingénieur,ymcoic@pasteur.fr)

Delafond Nathalie, IP (Agent de Laboratoire)

Dugué Laurence, IP (Technicienne Supérieure,ldugue@pasteur.fr)

Dutruel Olivier, IP (Technicien Supérieur,odutruel@pasteur.fr)

Fantini Emmanuelle, IP (Technicienne Supérieure,efantini@pasteur.fr)

Gouyette Catherine, IP (Ingénieur,oligos@pasteur.fr)

Groh François, IP (Technicien Supérieur,fgroh@pasteur.fr)

Guerreiro Catherine, IP (Technicienne Supérieure,cguerrei@pasteur.fr)

Helynck Olivier, IP (Technicien Supérieur)

Huteau Valérie, IP (Technicienne Supérieure,vhuteau@pasteur.fr)

Raghouber Josiane, IP (Agent de Laboratoire)

Ughetto-Monfrin Joël, CNRS (Ingénieur,ughetto@pasteur.fr)

Vieira Da Silva Francisco, IP (Agent de Laboratoire)


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