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Version PDF      Biochimie Structurale


  Responsable : ALZARI, Pedro M. (alzari@pasteur.fr)


  resume

 

Les travaux de recherche de l'Unité de Biochimie Structurale sont orientés vers l'étude de la structure tridimensionnelle de protéines et la spécificité des interactions protéine-ligands par les moyens de la cristallographie des rayons-X, la biochimie des protéines, la microcalorimétrie et la modélisation moléculaire. Les thèmes centraux de recherche comprennent l'enzymologie structurale de microorganismes pathogènes (mycobactéries, trypanosomes), les glycosidases et la reconnaissance moléculaire de sucres dans différents systèmes biologiques. Au cours de l'année 2002, plusieurs structures cristallines de protéines et de complexes protéine-ligand ont été déterminées dans le laboratoire. Les principaux résultats incluent les études structurales de la trans-sialidase de Trypanosoma cruzi, du facteur inducteur d'apoptose AIF, de la terminal desoxynucleotidyl transferase, et de la Ser/Thr protéine kinase PknB de Mycobacterium tuberculosis. Les principaux sujets de recherche sont décrits ci-dessous; plus d'information sur les différents projets de recherche en cours dans le laboratoire est disponible dans notre page Web :



  rapport

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Le facteur inducteur d'apoptose AIF (P.M. Alzari)

La mitochondrie joue un rôle clé dans la régulation de l'apoptose ou mort cellulaire programmée. Les facteurs mitochondriaux impliqués dans ce processus incluent le cytochrome c, certaines procaspases et le facteur inducteur d'apoptose AIF. Ce dernier est une flavoprotéine capable d'induire une voie d'apoptose indépendante des caspases. En collaboration avec l'équipe de G. Kroemer à Villejuif, nous avons purifié l'activité AIF à partir d'extraits mitochondriaux de souris et caractérisé ses propriétés moléculaires. La protéine AIF recombinante est capable d'induire la condensation de chromatine dans des noyaux isolés et la fragmentation à grande échelle de l'ADN, ainsi que la libération des protéines apoptogéniques à partir des mitochondries purifiées. Au cours de la dernière année, nous avons déterminé la structure tridimensionnelle de la protéine AIF murine à 2 Å de résolution. L'architecture du site actif et les propriétés redox de la protéine suggèrent que AIF fonctionne comme une transférase d'électrons dont le mécanisme est semblable à celui des férredoxine réductases d'origine bactérienne. Cependant, la structure 3D du facteur inducteur d'apoptose diffère de celles d'autres flavoenzymes, notamment par une longue insertion dans une boucle C-terminal qui pourrait être lié à sa fonction apoptogénique (Mate et al, Nature Struct. Biol., 2002).

Trans-sialidases de trypanosomes (P.M. Alzari)

Les protozoaires flagellés Trypanosoma cruzi, l'agent causal de la maladie de Chagas dans le continent américain, et T. brucei , l'agent de la maladie du sommeil en Afrique, expriment une trans-sialidase de surface capable de catalyser le transfert d'acide sialique entre différentes glycoprotéines. L'expression de cette enzyme chez T. cruzi est directement liée au pouvoir d'infection du parasite. En collaboration avec les équipes de A.C. Frasch (Argentine) et de S. Withers (Canada), nous avons entrepris l'analyse structurale d'enzymes homologues de trypanosomatides pathogènes (T. cruzi, T. brucei) et non-pathogènes (T. rangeli ) afin de comprendre les bases moléculaires de l'activité de transglycosylation (synthèse de polysaccharides) et de permettre la conception rationnelle d'inhibiteurs pouvant servir à des fins thérapeutiques.

Nous avons préalablement déterminé la structure 3D de la sialidase de T. rangeli à 2.2 Å de résolution (Buschiazzo et al, EMBO J., 2000) et réalisé des études de mutagenèse dirigée (Paris et al, Glycobiol., 2001) . Au cours de l'année dernière, nous avons étendu l'étude de l'enzyme complexée avec différents sucres à haute résolution. Ces études montrent que le site actif de la protéine présente une architecture rigide, laquelle n'est pas affectée par la fixation de ligands. La comparaison des structures 3D de différents complexes sialidase-inhibiteur — incluant des enzymes d'origine virale, bactérienne et de trypanosomes — révèle des caractéristiques distinctes, qui pourraient être exploitées pour la conception de nouveaux inhibiteurs spécifiques (Amaya et al, J. Mol. Biol., 2003) .

Nous avons aussi déterminé la structure cristalline de la trans-sialidase de T. cruzi à 1.6 Å de résolution, utilisant une approche systématique de mutagenèse de résidus de surface. L'analyse structurale de plusieurs complexes enzyme-ligand a mis en évidence que, à différence des sialidases, la fixation de l'acide sialique au site actif déclenche un "switch" conformationnel dans la trans-sialidase. Ces changements structuraux servent à moduler l'affinité pour le substrat accepteur, créant ainsi les conditions pour une activité de transglycosylation efficace. La comparaison structurale de la trans-sialidase de T. cruzi avec la sialidase de T. rangeli révèle un site catalytique très conservé, au sein duquel des subtiles modifications chimiques et structurales suscitent des changements remarquables dans l'activité catalytique et les propriétés d'inhibition des deux enzymes (Buschiazzo et al, Mol. Cell, 2002). En parallèle avec ces études, nous avons identifié et caractérisé le gène qui code pour la trans-sialidase du trypanosome africain T. brucei, l'agent de la maladie du sommeil chez l'homme et du ngana chez les animaux domestiques. L'enzyme de T. brucei présente les deux activités — hydrolyse et transfert — observées pour l'enzyme de T. cruzi, et sa caractérisation biochimique et structurale est actuellement en cours dans le laboratoire (Montagna et al, Eur. J. Biochem., 2002).

Protéines kinases et phosphatases mycobactériennes (P.M. Alzari)

La phosphorylation réversible des protéines est la principale modification post-translationelle impliqué dans la signalisation cellulaire des organismes vivants. Chez les bactéries, la plupart des voies de signalisation font intervenir les systèmes à deux composantes impliquant une His-kinase et un receveur, tandis que chez les eucaryotes l'information est acheminée grâce à des Sér-, Thr- ou Tyr-kinases et phosphatases agissant en cascades ou en réseaux. Ces dernières années, cependant, plusieurs gènes codant pour des Sér/Thr/Tyr protéines kinases ou phosphatases ont été identifiés chez différentes procaryotes et le séquençage systématique de génomes bactériens a confirmé ces observations. Ainsi, le génome de Mycobacterium tuberculosis montre la présence de plusieurs Sér/Thr protéines kinases et phosphoprotéines phosphatases probablement impliquées dans la signalisation intracellulaire. En collaboration avec l'équipe de S.T. Cole (IP), nous avons entrepris l'étude de cette famille de protéines mycobactériennes afin de comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents et de contribuer au développement des nouveaux outils thérapeutiques.

Au cours de la dernière année, nous avons focalisé nos travaux sur deux enzymes de M. tuberculosis en particulier, la Ser/Thr protéine kinase PknB et la Ser/Thr phosphatase PstP. Les gènes correspondantes, pknB et pstP, se trouvent dans un opéron très conservé chez les actinobactéries, qui serait impliqué dans la régulation de la synthèse du peptidoglycane au cours de la croissance cellulaire. Les domaines catalytiques de PknB et PstP ont été exprimés chez E. coli et les protéines recombinantes purifiées à homogénéité pour des études biochimiques (travail en cours). Nous avons aussi cristallisé et déterminé la structure 3D de PknB, qui represente la première structure d'une Ser/Thr protéine kinase d'origine procaryote. La structure de PknB complexée avec un analogue de l'ATP révèle l'enzyme dans un état actif. Cependant, la boucle d'activation est partiellement désordonnée, suggérant que la fixation du substrat peptidique est nécessaire pour stabiliser sa conformation. Des travaux sont en cours afin d'identifier les substrats physiologiques de PknB et de caractériser structuralement les complexes entre la protéine et différents inhibiteurs des protéines kinases eucaryotes (Ortiz et al, submitted).

La génomique structurale des mycobactéries (P.M. Alzari)

L'arrivée des données issues du séquençage massif des génomes a imposé une nouvelle dynamique à la biologie structurale, entraînant un changement d'échelle dans le domaine et une nécessité d'accélérer les processus d'études au niveau mondial. Cela est maintenant possible grâce aux développements technologiques remarquables réalisés pour le clonage, l'expression, la purification et la caractérisation des macromolécules biologiques, ainsi que par les progrès réalisés dans les méthodes de détermination de structures, la cristallogenèse, la cryocristallographie et le développement de nouvelles sources de radiation synchrotron, pour ne citer que ces exemples. Nous souhaitons utiliser ces technologies pour contribuer au développement d'une meilleure chimiothérapie de la tuberculose. En particulier, nous nous proposons d'utiliser la génomique structurale comme un outil innovateur pour la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques.

Grâce au soutien du Programme National des Génopoles, de deux projets européens (X-TB et SPINE) et de l'Institut Pasteur, nous avons entrepris un projet de génomique structurale de mycobactéries, en collaboration avec plusieurs autres laboratoires de l'Institut. Le choix initial de cibles s'appuie sur l'analyse comparative des génomes de M. tuberculosis et M. leprae. Ces cibles incluent, d'une part, des protéines impliquées dans la croissance bactérienne et/ou la virulence des mycobactéries, mais aussi un nombre important de protéines de fonction inconnue dont l'analyse génomique suggère leur possible importance comme cibles thérapeutiques potentielles. Au cours de l'année dernière, nous avons entrepris la mise en place des plateaux techniques nécessaires et commencé le sous-clonage systématique de gènes de M. tuberculosis et M. leprae, suivi de la production et la cristallisation des protéines recombinantes. A présent, plus d'une centaine de gènes ont été ainsi clonés et les premières protéines purifiées sont actuellement soumises à des essais de cristallisation. L'expérience acquise au cours de cette première phase du projet doit nous permettre d'améliorer les différentes méthodologies (stratégies de clonage, protocoles de purification et de cristallisation, analyses structurales, etc.), afin d'aborder dans un deuxième temps l'étude du protéome mycobactérien à plus grande échelle.

Biocalorimétrie et thermodynamique structurale (F. Schaeffer)

Les travaux de recherche en biocalorimétrie ont pour but la description quantitative des forces qui gouvernent la formation des complexes biomoléculaires. Cette approche, jointe à l'analyse structurale des molécules étudiées, ouvre la voie à la conception de molécules affines basée sur les principes de la thermodynamique. Les méthodes utilisées sont la calorimétrie de titration isotherme, la calorimétrie à balayage des températures, avec le développement de la thermodynamique statistique des interactions moléculaires qui permet la déconvolution des énergies d'association en termes structuraux. Au cours de cette dernière année, les travaux ont porté sur les interactions cohésine-dockérine et l'assemblage du cellulosome bactérien (Schaeffer et al, Biochem., 2002; Miras et al, Biochem., 2002), l'étude de spécificité de ligands d'une protéine d'E. coli, YajQ, dont la fonction est inconnue (Saveanu et al, Prot. Sci., 2002), et l'étude d'interactions protéine-protéine impliquant des facteurs sanguins (coll. avec C. Bon, IP) ou des protéines Tyr kinases impliquées dans l'activation des cellules T (coll. avec O. Acuto, IP).

Etude cristallographique de la terminal désoxynucléotidyltransférase (M. Delarue)

La terminal transférase appartient a la famille des polymerases beta, lambda et mu (ou pol X). Elle est capable d'élonger un "primer" (amorce) oligonucléotidique long d'au moins 3 bases, a partir des dNTP présents en solution, ajoutes aléatoirement puisque l'enzyme fonctionne sans matrice à recopier. On pense qu'elle est responsable in vivo de la génération d'une partie de la diversité du système immunitaire à travers l'élongation des régions N à la jonction V(D)J des gènes des immunoglubulines. Le but de cette étude, en collaboration avec l'Unité de Biochimie et de Génétique du Développement (IP), est de caractériser structuralement la spécificité relativement étendue de cette enzyme vis-à-vis de nucléotides triphosphates modifiés et le rôle des ions métalliques dans le site actif. La structure du domaine catalytique a été résolue a 2.35 Angstrom de résolution en 2001 (Delarue et al, EMBO J., 2002). Des complexes avec un oligonucléotide primer oligo(Br-dU) et un dNTP rentrant ont également été affinés à moyenne résolution. Cette année, nous avons enregistré des données à plus haute résolution pour un complexe binaire avec un oligonucléotide oligo(A) à 2.1 Å et plusieurs autres complexes avec des dNTP rentrant (purine ou pyrimidine) en présence de divers ions divalents. L'analyse est en cours.

D'autre part, nous avons calculé les modes normaux de plus basse fréquence pour la plupart des structures de polymerases DNA-dependantes déposées dans la PDB pour lesquelles à la fois la structure ouverte et la structure fermée sont connues. Nous avons trouvé que dans tous les cas, une poignée de modes normaux de basse fréquence suffisent à expliquer la quasi-totalité de la transition entre les deux formes (Delarue et al, J. Mol. Biol., 2002). Ceci est indépendant de la famille structurale à laquelle elles appartiennent et apparaît comme une caractéristique générale des polymerases. Nous comptons poursuivre cette étude en générant des structures plausibles intermédiaires entre les deux formes, afin de comprendre l'origine moléculaire de la translocation de l'ADN.

Etude cristallographique des TMP kinases bactériennes (M. Delarue)

La TMP kinase est une cible potentielle nouvelle pour le design d'antibiotiques contre la tuberculose. La structure cristallographique a 1.9 Å de résolution et a été résolue et publiée en 2000-2001. L'analyse de la structure en comparaison avec les autres structures disponibles de TMP Kinases bactériennes et d'eucaryotes a été effectuée et a révélé des différences (par exemple la présence d'un ion Magnésium fixe au TMP) permettant d'envisager de nouveaux inhibiteurs. Nous avons étudié ces inhibiteurs potentiels enzymatiquement, puis tenté des les cocristalliser. L'étude cristallographique de deux complexes de cette protéine avec des inhibiteurs a été effectué. L'un (avec l'inhibiteur analogue du bisubstrat) a révélé un nouveau site de fixation de la partie ATP, inattendu par rapport aux autres enzymes de cette famille. Ceci permet d'envisager la conception de molécules inhibitrices vraiment spécifiques de M. tuberculosis. L'autre (avec le 5-CH2OH-dUMP) a mis en évidence le rôle de la Ser99, un résidu strictement conservé dont le rôle etait jusqu'a présent inexpliqué. Il fait partie d'une "triade catalytique" fonctionnant en sens inverse et chargée de reprotoner le groupement phosphoryle transféré. C'est la première fois qu'un tel rôle est proposé dans un membre de la famille des NMP kinases (Haouz et al, J. Biol. Chem., 2002).

The research activities of the Unit of Structural Biochemistry are oriented towards the study of the three-dimensional structure and ligand-binding specificity of proteins by X-ray crystallography, protein biochemistry, microcalorimetry and molecular modelling techniques. The major themes of research involve structural studies of enzymes from microbial pathogens (mycobacteria, trypanosomatids), bacterial glycosidases and protein-carbohydrate complexes in different biological systems. During the last year, several new crystal structures of proteins and protein complexes have been determined in the laboratory. Major results include the structural studies of the trans-sialidase from Trypanosoma cruzi, the apoptosis-inducing factor AIF, the terminal desoxynucleotidyl transferase and the Ser/Thr protein kinase PknB from Mycobacterium tuberculosis. The main lines of research in the laboratory are described below; further information on these and other research subjects can be found in our Web page

Mots-clés: biologie structurale, protéines kinases bactériennes, glycosidases et glycosyl transferases, tuberculose, Trypanosoma cruzi, génomique structurale



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Fejt, Françoise (ffejt@pasteur.fr) Alzari, Pedro M., IP (Chef de Laboratoire,alzari@pasteur.fr)

Delarue, Marc, CNRS (DR2,delarue@pasteur.fr)

Schaeffer, Francis, IP (CR,fschaeff@pasteur.fr)

Amaya, Maria Fernanda, Post-doc (amaya@pasteur.fr)

Azuara, Cyril, Thèse (azuara@pasteur.fr)

Buschiazzo, Alejandro, Post-doc (alebus@pasteur.fr)

Guerin, Marcelo, Post-doc (mguerin@pasteur.fr)

Fernandez, Pablo, Post-doc (fpablo@pasteur.fr)

Hagnerelle, Xavier, Thèse (hagnerel@pasteur.fr)

Villarino, Andrea, Post-doc (avilarin@pasteur.fr)

Wehenkel, Annemarie, Thèse (wehenkel@pasteur.fr)

Bellune, Alban, IP (Agent de Laboratoire)

Expert-Besançon, Nicole, IP (Ingénieur,nexpert@pasteur.fr )

Formentin, Chantal, IP (Agent de Laboratoire)

Nguyen, Tong, IP (Ingénieur,tong@pasteur.fr )

Souchon, Hélène, CNRS (Ingénieur,hsouchon@pasteur.fr )

Tello-Manigne, Diana, IP (Ingénieur,dtello@pasteur.fr )

Toscan, Isabelle, IP (Agent de Laboratoire)


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