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Version PDF      Bactériologie Moléculaire et Médicale


  Responsable : BARANTON Guy (gbaran@pasteur.fr)


  resume

 

La possibilité d'inactiver des gènes chez Leptospira ouvre la voie à l'étude de leur fonction. La participation des récepteurs "Toll-like" dans les réponses d'immunité innée générées par les leptospires ou par le lipopolysaccharide est en cours d'étude. Chez Borrelia, l'analyse du gène ospC confrontée à la phylogénie du genre permet de distinguer trois populations bactériennes distinctes : invasive, cutanée et non infectieuse pour les vertébrés. Chez les Yersinia, l'analyse de déterminants chromosomiques et leur comparaison chez les différentes espèces pathogènes ont ouvert une nouvelle voie d'approche vers une meilleure compréhension des mécanismes responsables du pouvoir pathogène exceptionnel de Y. pestis.



  rapport

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LEPTOSPIRES

Récepteurs "toll-like"(TLRs) et lipopolysaccharide (LPS) des leptospires. (C. Werts, E. Fournié-Amazouz, M-A. Nahori et I. Saint Girons)

Les pathogènes bactériens activent le système d'immunité innée de l'hôte via les récepteurs "toll-like" qui reconnaissent des composants conservés des bactéries (LPS, peptidoglycane, lipoprotéines, ADN ...). Nous avons montré que le LPS de Leptospira interrogans active les macrophages via les récepteurs CD14 et TLR2, contrairement aux LPS des entérobactéries qui utilisent TLR4 (Werts et al., 2001). La structure du lipide A du LPS de L. interrogans a été déterminée par le groupe de C.R.H. Raetz (Université Duke, Durham, USA) (Que et al., en préparation). Nous étudions à présent les relations entre la structure et les fonctions de ce lipide A particulier, qui n'est pas endotoxique et n'a pas le même usage des TLRs que le lipide A d'Escherichia coli. Ces données apportent de nouvelles informations concernant la réponse immunitaire innée pendant l'infection par Leptospira.

Par ailleurs, l'obtention récente d'un dérivé clonal de L. interrogans ayant perdu son pouvoir pathogène chez le cobaye permet d'envisager l'étude des facteurs de virulence.

Inactivation de gènes chez les leptospires saprophytes. (M. Picardeau, A-P. Tchamedeu-Kameni, H. Bauby, E. Couture-Tosi et I. Saint Girons)

Depuis quelques années, nous avons développé les premiers outils génétiques (vecteur navette, système d'inactivation de gènes, marqueur de contre-sélection) pour étudier les leptospires saprophytes. Ceci nous a ainsi permis d'inactiver le gène recA de L. biflexa. Le mutant recA présente une faible viabilité en milieu solide et liquide et une augmentation de la sensibilité aux agents dégradant l'ADN (U.V., mitomycine C). De plus, l'observation microscopique des cellules recA- montre des nucleoïdes de morphologie atypique. Ces résultats montrent que la protéine RecA de L. biflexa joue un rôle majeur dans la viabilité cellulaire par l'intermédiaire de mécanismes tels que la réparation de l'ADN et, indirectement, la ségrégation des chromosomes. Nous avons aussi obtenu le premier mutant auxotrophe chez les leptospires (le mutant trpE de L. meyeri qui est auxotrophe pour le tryptophane) et nous avons identifié un second marqueur de sélection, la cassette de résistance à la spectinomycine, pour les manipulations génétiques chez les leptospires.

CNR et CCOMS des Leptospires.

Voir : http://www.pasteur.fr/sante/clre/cadrecnr/lepto-index.html

D. Postic et G. Baranton en collaboration avec l'INVS : cas groupés de leptospirose.

La survenue de cas groupés de leptospirose à Rochefort (Charente-Maritime), détectée tout d'abord par PCR, a entrainé une étude en premier lieu sérologique. Une enquête épidémiologique diligentée par l'INVS (Institut de Veille Sanitaire) a révélé que 5 enfants et adolescents s'étaient contaminés à l'occasion de baignades dans un canal normalement interdit à cet usage.

D. Postic en collaboration avec D. Raoult et P. Brouqui : un cas de leptospirose inhabituel.

A été décrit à Marseille un cas clinique de leptospirose avec isolement de L. fainei, une espèce de Leptospire dont la pathogénicité est controversée.

Consulter également : http://www.pasteur.fr/recherche/Leptospira/LeptospiraF.html

BORRELIA

Voir : http://www.pasteur.fr/recherche/borrelia/Welcome.html

Borrelia et VNTRs (J. Ferlow, D. Postic, K.L. Smith, Z. Jay, G. Baranton et P. Keim).

En collaboration avec l'équipe de Paul Keim aux Etats-Unis (Northern Arizona Faculty Flagstaff), une étude portant sur 41 souches de Borrelia à l'aide de marqueurs VNTR (Variable Number of Tandem Repeats), a montré que 33 de ces souches se répartissaient comme prévisibles en 3 groupes correspondant aux 3 espèces pathogènes pour l'homme : Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia garinii et Borrelia afzelii. Par contre, 8 souches identifiées comme Borrelia burgdorferi sensu stricto exhibent une diversité supérieure à la diversité interspécifique. Ces résultats inattendus vont faire l'objet d'une étude complémentaire visant à démontrer qu'il s'agit d'une population ancestrale à l'origine de 3 clones pathogènes correspondant à chacune des espèces pathogènes actuelles.

OspC et pathogénicité de Borrelia (V. Lagal, D. Postic et G. Baranton).

Les études du gène ospC codant une protéine de membrane de Borrelia ont objectivé que les génotypes correspondant au phénotype invasif sont plus nombreux qu'estimé auparavant et que la prévalence de chacun d'eux est géographiquement déterminée en Europe. La diversité est liée à la pression sélective des anticorps mais la répartition associée à la géographie n'a pas reçu d'explication satisfaisante et ce d'autant qu'aux Etats-Unis l'hétérogénéité en une zone donnée est de règle. C'est en rapprochant ce travail du précédent que nous avons pu établir la non-pathogénicité des 8 souches que nous considérons comme des représentants d'une population ancestrale non transmissible aux vertébrés.

CNR Borrelia(D. Postic, E. Ferquel et C. Pérez-Eid).

Voir : http://www.pasteur.fr/sante/clre/cadrecnr/borelia-index.html

La borréliose de Lyme, la plus fréquente des maladies à vecteurs en Europe comme en Amérique du Nord, fait l'objet de deux axes de recherche : l'un concerne le vecteur et les bactéries pathogènes transmises, l'autre l'incidence humaine de la maladie en France.

En Europe, I. ricinus, la tique vectrice de la borréliose de Lyme, transmet les trois espèces pathogènes du complexe B. burgdorferi, responsables des cas humains. Chacune de ces trois espèces semble associée à des manifestations cliniques différentes, d'où l'intérêt d'en connaître les distributions respectives. Une telle approche ne peut s'effectuer qu'à partir des tiques. En 2002, nous avons pratiqué des collectes de tiques, d'une part, en Bretagne et, d'autre part, dans le centre de la France (département de l'Allier). Les collectes sont faites sur des bases statistiques strictes, selon la méthode mise au point antérieurement par notre équipe, qui permet une évaluation de la densité des tiques. La recherche des bactéries chez les tiques, se fait par PCR.

L'incidence humaine de la borréliose de Lyme en France est actuellement inconnue puisque les chiffres fluctuent, d'après deux études anciennes, entre 16,4 et 40 cas pour 100 000 habitants. Notre objectif est, d'une part, de réduire cette trop large fourchette afin de donner une idée plus exacte de la situation en France et, d'autre part, de mettre en évidence d'éventuelles différences régionales, au niveau incidence et tableau clinique. Ce travail est mené selon deux approches : une étude rétrospective à partir de demandes de sérodiagnostics parvenues au laboratoire Pasteur-Cerba, l'un des deux plus importants laboratoires français, et une étude prospective s'appuyant sur un réseau de surveillance constitué de médecins libéraux et hospitaliers, généralistes et spécialistes et de biologistes.

YERSINIA (Responsable : E. Carniel)

Le genre Yersinia comprend 3 espèces pathogènes pour l'homme : les espèces entéropathogènes, Y. pseudotuberculosis et Y. enterocolitica, et l'agent de la peste, Y. pestis.

Les principaux axes de travail du laboratoire des Yersinia sont :

- la caractérisation d'un îlot de pathogénicité qui confère aux souches qui l'hébergent la capacité de provoquer des infections systémiques chez l'homme et l'animal ;

- les bases moléculaires du pouvoir pathogène exceptionnel de Y. pestis. Pour cela, le séquençage du génome de Y. pseudotuberculosis, bactérie "jumelle" mais de virulence bien moindre, vient d'être achevé. Une analyse de génomique comparative est maintenant en cours ;

- les relations de Y. pestis avec son insecte vecteur, la puce ;

- la physiopathologie de l'infection à Yersinia ;

- l'évolution de Y. pestis depuis son apparition récente à partir de Y. pseudotuberculosis ;

- la résistance aux antibiotiques et l'évaluation de nouveaux traitements ;

- la santé publique (Centre National de Référence et Centre Collaborateur de l'OMS).

Les travaux ayant fait l'objet de publications en 2002 sont les suivants:

Comparison de l'effet de la Défériprone et de la Déféroxamine sur la croissance et la virulence de Yersinia enterocolitica. (B. Lesic, J. Foulon et E. Carniel).

Différentes pathologies humaines s'accompagnent d'une surcharge martiale (thalassémies, hémochromatose, anémies hémolytiques, etc) dont le traitement consiste en l'administration de Déféroxamine, un sidérophore produit par Streptomyces pilosus et capable de chélater l'excès de fer circulant. Les Yersinia peuvent utiliser cette molécule comme sidérophore exogène, grâce à un récepteur membranaire spécifique. Cet apport en fer leur permet de se multiplier in vivo, de disséminer dans l'organisme et de causer des septicémies. Une firme canadienne a mis au point une nouvelle molécule, la Défériprone, possédant un pouvoir chélateur du fer tout à fait comparable à celui de la Déféroxamine. Cependant, la capacité de cette nouvelle molécule à promouvoir la croissance des Yersinia n'a jamais été évaluée. L'évaluation de cette propriété a été confiée à notre laboratoire. La croissance in vitro de Y. enterocolitica en présence de différentes concentrations de Défériprone a été mesurée et comparée à celle obtenue en présence de Déféroxamine. Dans ces conditions, nous avons montré que contrairement à la Déféroxamine, la Défériprone ne favorisait pas la croissance de Y. enterocolitica. Des tests in vivo dans le modèle expérimental murin ont également montré que la Défériprone, à l'inverse de la Déféroxamine, n'augmentait pas la virulence de cette bactérie et ne favorisait pas les infections systémiques. La Défériprone représente donc un traitement alternatif à la Déféroxamine tout à fait intéressant, en particulier lors d'infections systémiques à Y. enterocolitica.

La transposition de IS1397 ne nécessite pas la présence d'unités palindromiques chez Yersinia pestis. (E. Carniel - Collaborateurs : C. Wilde, S. Bachelier, M. Hofnung et J-M. Clément).

La séquence d'insertion IS1397 de E. coli s'insère de façon hautement préférentielle dans des séquences répétées appelées Unités Palindromiques (UP) qui sont réparties sur le chromosome de cette espèce et sur celui d'autres genres d'entérobactéries tels que Klebsiella ou Salmonella. Curieusement, Y. pestis ne contient aucune séquence UP mais IS1397 est cependant capable de transposer sur son génome. Cette transposition se produit au niveau de hot spots d'intégration. Nos résultats suggèrent une reconnaissance directe de la séquence ADN cible par la transposase de l'IS1397.

Acquisition à haute fréquence, dans le proventricule de la puce, de plasmide de résistance aux antibiotiques par Yersinia pestis. (M.L. Rosso, E. Carniel — Collaborateurs : J. Hinnebusch et T.G. Schwan).

Des souches de Y. pestis ayant acquis des plasmides de résistance aux antibiotiques ont été récemment isolées. Une des grandes questions, tant d'un point de vue fondamental que de santé publique, est d'identifier l'étape du cycle épidémiologique de Y. pestis au cours de laquelle la bactérie peut acquérir ces plasmides de résistance. Chez l'hôte vertébré, le bacille pesteux est inoculé au niveau du tissus sous-cutané et circule dans un environnement stérile jusqu'à la phase septicémique qui précède la mort. Le bacille n'est donc théoriquement pas en contact avec des bactéries donatrices. Par contre, une étape où Y. pestis pourrait être en contact étroit avec d'autres genres bactériens est lors de son passage chez la puce. Dans cette étude, la possibilité qu'un transfert de plasmides de résistance aux antibiotiques se produise chez l'insecte vecteur a été évaluée. Nous démontrons que, lors d'une co-infection expérimentale de la puce, un contact étroit entre un E. coli donateur et la souche de Y. pestis réceptrice a lieu dans le proventricule de l'insecte. Après quatre semaines de co-infection, 95% des puces hébergent des clones de Y. pestis ayant acquis la résistance à l'antibiotique. La fréquence de transfert conjugatif du plasmide de E. coli vers Y. pestis est très élevée (103/bactérie donatrice) et proche de celle observée dans les conditions optimales du laboratoire. Le proventricule de la puce est donc une niche écologique très favorable aux échanges génétiques chez Y. pestis.

La réaction inflammatoire induite par des glycolipides de Yersinia pseudotuberculosis contient des cellules NKT. (F. Guinet, E. Carniel — Collaborateurs : C. Ronet, M. Mempel, M. Huerre et G. Gachelin).

Alors que l'exploration de l'immunité adaptatrice au cours des yersinioses a permis de mettre en évidence l'importance d'une réaction cellulaire de type Th1, les événements précoces de l'immunité cellulaire sont peu connus. Ceux-ci sont pourtant, selon toute vraisemblance, importants pour déterminer l'évolution différentielle sur les quelques heures/jours qui suivent une infection à Y. pestis ou Y. pseudotuberculosis. Afin d'étudier ce type de réponse au cours des infections à Yersinia, nous avons entrepris l'analyse de la réponse cellulaire générée in vivo, dans un modèle murin, après injection d'extraits hydrophobes de Y. pseudotuberculosis. Un infiltrat inflammatoire aigu avec abondance de lymphocytes T est observé dès 48h. La majorité des cellules recrutées sont des cellules T Valpha14. Les glycolipides de Y. pseudotuberculosis induisent donc une réponse inflammatoire comparable à celle de Mycobacterium tuberculosis malgré des composés de parois très différents.

Centre National de Référence des Yersinia et Centre Collaborateur de l'OMS (L. Martin, F. Guinet et E. Carniel)

Voir : http://www.pasteur.fr/sante/clre/cadrecnr/yersinia-index.html

Génomique comparative de Y. pestis et Y. pseudotuberculosis (V. Chenal, D. Dacheux, A. Derbise, E. Carniel — Collaborateurs : E. Garcia, P. Chain et C. Médigue).

Une analyse comparative des génomes de Y. pestis et de Y. pseudotuberculosis (bactérie génétiquement très proche de Y. pestis mais de virulence bien moindre) pourrait aider à l'identification de gènes responsables du pouvoir pathogène exceptionnel de Y. pestis. Grâce à une collaboration entre le Lawrence Livermore National Laboratory aux États-Unis et notre laboratoire, le séquençage du génome de Y. pseudotuberculosis vient d'être achevé. La phase de génomique comparative est maintenant en cours.

Mots-clés: Spirochètes, Leptospira, Borrelia, TLR, lipide A, LPS, échange allélique, épidémiologie, phylogénie, VNTR, OspC, Yersinia, génomique, virulence



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BARANTON Guy IP Chef d’Unité gbaran@pasteur.fr

POSTIC Danièle IP Médecin dpostic@pasteur.fr

SAINT GIRONS Isabelle IP Chef de laboratoire isgirons@pasteur.fr

CARNIEL Elisabeth IP Chef de laboratoire carniel2@pasteur.fr

FERQUEL Elisabeth IP Médecin eferquel@pasteur.fr

PEREZ-EID Claudine IP Chef de laboratoire cperez@pasteur.fr

CHAUVAUX Sylvie IP Chargée de recherche chauvaux@pasteur.fr

GUINET Françoise IP Chargée de recherche fguinet@pasteur.fr

PICARDEAU Mathieu IP Chargé de recherche mpicard@pasteur.fr

WERTS Catherine IP Chargée de recherche cwerts@pasteur.fr

DERBISE Anne Post doctorante aderbise@pasteur.fr

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LAGAL Vanessa Thèse vlagal@pasteur.fr

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CHENAL Viviane Technicienne vchenal@pasteur.fr

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DESNOUES Nicole Technicienne CRBIP desnoues@pasteur.fr

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FAVRE Denise Détachée Centre médical defavre@pasteur.fr

FOULON Jeannine Technicienne jfoulon@pasteur.fr

FOURNIE Edith Technicienne serpu@pasteur.fr

GALUPA Isabel Agent de laboratoire galupa@pasteur.fr

GARNIER Martine Technicienne mgarnier@pasteur.fr

GUINANDIE Françoise Agent de laboratoire guinandi@pasteur.fr

MARTIN Liliane Technicienne limartin@pasteur.fr

NAHORI Marie-Anne Ingénieur manaho@pasteur.fr

SERTOUR Natacha Technicienne nsertour@pasteur.fr

TATOT Véronique Aide de laboratoire tatot@pasteur.fr

WISZNIOWSKI Karine Aide de laboratoire kwisznio@pasteur.fr

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