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Version PDF      Biochimie Microbienne


  Responsable : André KLIER (aklier@pasteur.fr)


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L'Unité de Biochimie Microbienne étudie la régulation de l'expression génétique chez les bactéries Gram-positives modèles (Bacillus, Streptomyces) et a poursuivi l'élargissement de sa thématique de recherche à l'étude des facteurs de virulence et à leur expression chez des bactéries pathogènes (Listeria, Streptocoques, Staphylocoques).



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Etude du régulon sigma 54 de Bacillus subtilis (M. Débarbouillé, J. Bignon, N. Ould Ali)

Le gène sigL de B. subtilis code pour un facteur sigma de type sigma 54, requis pour l'utilisation d'aminoacides comme sources d'azote et de carbone. La protéine RocR appartient à la famille NtrC/NifA, dont les membres se lient à des séquences de type enhancer, appelées UAS, contrôle deux opérons : rocABC et rocDEF, impliqués dans la dégradation de l'arginine et l'ornithine en glutamate. Les deux opérons ont des promoteurs sigL dépendant et sont induits par l'arginine ou l'ornithine. Le gène rocG qui code pour une glutamate déshydrogénase, est localisé juste en amont de l'opéron rocABC. Sa transcription est elle aussi activée par RocR. A la différence des autres gènes dépendant de sigma 54, rocG n'a pas d'UAS et son expression dépend d'une séquence appelée DAS, localisée en aval du gène rocG et qui sert d'UAS pour le promoteur de l'opéron rocABC. La protéine RocR se fixe sur l'ADN sur deux régions palindromiques de 17 paires de bases appelées UAS/DAS. Des mutations introduites par mutagénèse dirigée dans chacune de ces deux cibles de RocR affectent simultanément l'expression du gène rocG et celle de l'opéron rocABC. En collaboration avec Eric Larquet (Institut Pasteur), une étude de la structure de l'ADN de la région rocG rocABC a permis de montrer l'existence d'une courbure stable localisée dans la région UAS/DAS, qui permet d'expliquer comment la protéine RocR en interagissant avec les UAS/DAS, stimule l'ARN polymérase fixée au promoteur de l'opéron rocABC.

Réponse à l'environnement chez Bacillus subtilis et d'autres bactéries Gram-positives (T. Msadek, A. Chastanet, S. Dubrac, J. Fert, O. Poupel)

Les travaux de recherche concernent la réponse aux stress et la transmission de signaux par les systèmes à deux composants chez Bacillus subtilis et des bactéries pathogènes à Gram positif (Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae et Listeria monocytogenes), impliquant notamment une analyse génomique fonctionnelle.

Chez Listeria monocytogenes, une collection de mutants d'inactivation de gènes codant pour des systèmes à deux composants a été réalisée. Un système similaire au système Agr de S. aureus semblerait impliqué dans la communication entre cellules de type quorum-sensing peptidique, le seul de ce type identifié chez L. monocytogenes. Une analyse du transcriptome du mutant correspondant a été réalisée avec des membranes à haute densité (Génopole de l'Institut Pasteur) et environ 20 gènes ont ainsi été identifiés comme étant contrôlés positivement par le système Agr chez L. monocytogenes. Parmi ceux-ci, on retrouve la quasi-totalité des gènes de virulence connus chez L. monocytogenes, correspondant au régulon PrfA.

Une analyse du transcriptome de L. monocytogenes à également été effectuée en présence ou en absence du gène sigH surexprimé, qui code pour un facteur sigma alternatif. Parmi environ 30 gènes contrôlés positivement, on note plusieurs gènes impliqués dans la biosynthèse de la paroi, le métabolisme des acides lipotéichoïques, ou codant pour des protéines de surface ancrées à la paroi par le motif LPXTG, des protéines exportées impliquées dans la virulence, ainsi que plusieurs membres du régulon de virulence PrfA.

Les bactéries à Gram-positif possèdent un système à deux composants qui se révèle essentiel à la survie de la bactérie, le système YycG/YycF. Les protéines YycG et YycF de Bacillus subtilis ont été purifiées et utilisées dans des expériences d'interactions protéine/ADN in vitro avec les régions amont de plusieurs gènes cibles potentiels. Ceci a permis de déterminer une séquence consensus qui pourrait constituer la cible du régulateur YycF.

Etude de la pathogénicité de Staphylococcus aureus

S. aureus est une bactérie pathogène importante impliquée dans un grand nombre d'infections chez l'homme, allant des lésions superficielles à des infections plus graves, telles que les ostéomyélites, endocardites, pneumonies, septicémies et le syndrome du choc toxique. En dépit d'efforts intensifs, peu de données sont encore disponibles sur les bases moléculaires de la pathogénicité.

Contribution d'outils moléculaires (M. Débarbouillé, M. Arnaud, J. Bignon)

L'inactivation des gènes étant un événement relativement peu efficace chez S. aureus, un nouveau vecteur plasmidique d'inactivation appelé pMAD, a été construit au laboratoire. Il porte une origine de réplication thermosensible et un gène exprimant une béta-galactosidase de façon constitutive permettant une détection rapide et simple d'événement de double recombinaison sur milieu salin contenant du X-Gal. Ce nouveau plasmide a été testé avec succès chez S. aureus et L. monocytogenes et plusieurs gènes potentiellement impliqués dans la virulence de S. aureus sont en cours d'étude.

Une banque de promoteurs constituée de fragments d'ADN de S. aureus introduits sur un plasmide multicopie comportant comme gène rapporteur le gène lacZ a été construite et introduite chez S. aureus. Cette banque a été utilisée pour rechercher des gènes dont l'expression répond à divers stress ou est régulée dans des conditions de culture particulières. Plusieurs promoteurs des gènes ainsi identifiés par cette approche sont en cours d'étude.

Les oligopeptides perméases (Opp) sont des membres d'une famille de transporteurs à large spectre. Cinq gènes similaires des gènes de l'opéron oppABCDF de B. subtilis sont présents chez S. aureus. Cet opéron de type Opp a été inactivé et la virulence du mutant a été étudiée dans le modèle murin, en collaboration avec l'équipe de Jean-Michel Alonso. Les résultats obtenus ont montré que cet opéron n'est pas impliqué dans la virulence. Une dizaine de systèmes de type Opp sont présents chez S. aureus et leur étude est en cours.

Etude du système à deux composants ArlS/ArlR (B. Fournier)

Le système ArlS/ArlR intervient dans la virulence de S. aureus en réprimant l'expression des gènes de certains facteurs de virulence comme la protéine A et la toxine a. Le système Arl semble agir sur l'expression de gènes codant pour ces facteurs par l'intermédiaire de SarA (un régulateur global de la virulence) par un mécanisme non encore élucidé. L'étude du système Arl se poursuit dans plusieurs directions : l'une d'elle consiste à identifier d'autres gènes cibles de ce système par une approche protéomique. Par exemple, l'expression de certains gènes de protéines de la paroi telles que les adhésines est modifiée quand l'opéron arl n'est pas exprimé. Un autre axe consiste à rechercher le signal détecté par le système arl.

Régulation de l'expression du régulon PlcR chez les bactéries du groupe Bacillus cereus (D. Lereclus, M. Gominet, V. Sanchis, L. Slamti, J. Brillard)

PlcR est un régulateur pléiotrope qui active la transcription de nombreux gènes de virulence chez Bacillus thuringiensis et Bacillus cereus. L'analyse de la séquence du génome de B. cereus et du protéome extracellulaire indiquent que plus de 50 gènes sont potentiellement régulés par PlcR. La délétion du gène plcR chez ces bactéries conduit à une diminution du pouvoir pathogène chez l'insecte et la souris.

L'expression du régulon PlcR est contrôlée à deux niveaux :

1 - Le facteur clé responsable de l'initiation de la sporulation, Spo0A, réprime l'expression du gène plcR au moment où la bactérie commence à s'engager dans le processus de sporulation. Cette répression est due à la fixation de Spo0A~P sur deux séquences situées de part et d'autres de la cible reconnue par PlcR pour sa propre activation.

2 - Un gène (papR) lui-même régulé par PlcR, conduit à la synthèse d'un peptide de 48 acides aminés portant une séquence signal d'exportation. Une partie du peptide est donc diffusible dans le milieu extracellulaire et peut être réimportée dans la cellule bactérienne, sous forme d'un pentapeptide, via le système de perméation Opp. Le pentapeptide interagit avec la protéine PlcR permettant ainsi sa fixation sur les séquences d'ADN cible. Au moins trois types de pentapeptides (LPFEF, MPFEF, VPFEF) ont été identifiés chez les bactéries composant le groupe B. cereus. Ce système de signalisation moléculaire permet donc aux bactéries d'un même sous-groupe de produire un ensemble de facteurs de virulence quand leur densité dans le milieu est suffisante (quorum sensing).

Différenciation chez Streptomyces, implication de protéases et de chaperons (P.  Mazodier, A. Bellier, C. Lavire)

Les Streptomyces ont un cycle morphologique complexe proche de celui des champignons filamenteux. Ce cycle passe par la formation d'un mycélium basal, puis d'un mycélium aérien, celui-ci subit ensuite une septation pour se différencier en spores. Cette différenciation morphologique est accompagnée d'une différenciation métabolique qui fait des Streptomyces le genre bactérien le plus riche en producteurs d'antibiotique.

Chez Streptomyces, une étude des protéases ATP-dépendantes et spécialement du complexe protéolytique Clp a été entreprise. Chez S. lividans, cinq gènes clpP sont présents. clpP1 est impliqué dans la différenciation morphologique et la production d'antibiotiques. L'opéron clpP3 clpP4 est régulé par l'activateur PopR. Nous avons montré que les protéases ClpP dégradent PopR, ce qui permet une expression contrôlée de l'opéron clpP3/clpP4. Les genes clpP1 clpP2 semblent être sous le contrôle d'un autre régulateur ClgR. Une mutation affectant l'ATPase ClpX a été obtenue ; le phénotype de ce mutant n'est pas identique à celui des mutants clpP ; ce qui montre que les sous-unités ClpC1 et/ou ClpC2 doivent aussi être fonctionnelles. L'analyse du rôle de ces ATPases ainsi que de la sous-unité régulatrice ClpS a été entreprise.

L'étude du système ssrA de Streptomyces a été initiée. L'ARN codé par ssrA possède les propriétés mixtes d'un tARN et d'un ARN messager. Il permet l'étiquetage spécifique des protéines dont la biosynthèse est arrêtée au cours de la traduction. Ces peptides sont adressés pour une dégradation par protéolyse. Des mutations du gène ssrA et du gène codant pour SmpB, une protéine nécessaire à l'action de SsrA ont été construites chez Streptomyces. Les phénotypes des mutants indiquent que le système ssrA ne semble pas contrôler la différenciation des Streptomyces. Cependant, la traduction limitée de certains gènes régulateurs laissent penser que le système ssrA pouvait avoir un rôle en favorisant la dégradation de certaines protéines régulatrices. Cette hypothèse est actuellement testée.

Finalement nous avons entrepris l'étude de ArmX une protéine dont la production est induite en conditions de choc thermique et de stress oxydatif. ArmX pourrait être un chaperon d'un type nouveau.

Photo 1- Analyse du transcriptome de L. monocytogenes obtenu en surexprimant ou non le gene sigH codant pour un facteur sigma alternatif.L'ensemble des gènes de Listeria monocytogenes est présent sur une membrane à haute densité. Les points rouges indiquent les gènes dont l'expression est réprimée par SigH, les points verts ceux dont l'expression est activée par SigH, les points jaunes les gènes qui ne sont pas contrôlés par SigH et les points noirs les gènes qui ne sont pas exprimés dans les conditions utilisées.

Photo 2 — Modèle de régulation de l'expression du régulon PlcR. Le peptide PapR est sécrété dans le milieu extracellulaire, puis est réimporté dans les cellules bactériennes, via le système Opp, vraisemblablement sous la forme d'un pentapeptide et interagit avec la protéine PlcR, et lui permet de se fixer sur sa séquence cible (boîte PlcR) pour activer l'ensemble du régulon PlcR.

Mots-clés: Bactéries Gram-positives, expression génétique, facteurs de virulence, réponses au stress, transduction de signal



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SLAMTI Leyla Etudiante en thèse lslamti@pasteur.fr

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