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Version PDF      Biologie Moléculaire du Gène - INSERM U277


  Responsable : Philippe KOURISLKY - Gabriel GACHELIN (ggachel@pasteur.fr)


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D'une manière générale, l'unité a poursuivi des études sur la diversité des lymphocytes T et B et sur les fonctions de diverses sous populations de lymphcocytes T en pathologie.



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Caractérisation et origine des lymphocytes intra-épithéliaux CD3-/TCR- de l'intestin de sprues réfractaires. Orly Azogui

La maladie coeliaque est une entéropathie induite par les A-gliadines. Pour un petit nombre de patients, elle donne naissance à des complications graves au cours desquelles le régime sans gluten ne permet pas de rémission. L'une de ces complications appelée sprue réfractaire (SR) induit un syndrome de malabsorption très sévère, pour lequel il n'existe pas de traitement efficace. La SR est caractérisée par la présence d'une population monoclonale de lymphocytes intra-épithéliaux qui, bien qu'ils n'expriment pas de complexe CD3/TCR contiennent des marqueurs de la lignée T tels que l'expression d'une chaîne CD3 intracellulaire et la présence de remaniements bi-alléliques dans le locus TCRN avait pour but de caractériser le linéage des cellules CD3-/TCR- et de mettre en évidence un mécanisme pouvant être responsable de la perte d'expression de surface du TCR. Nos travaux récents sur le phénotype et la caractérisation des gènes du TCR montrent que pour certains patients, les cellules CD3-/TCR- sont des cellules T matures qui appartiennent à la lignée T de type . Les travaux basés sur l'hypothèse de l'hyper-activation d'un clone T  et l'internalisation irréversible du TCR consécutive à l'activation de ce clone sont en cours d'étude. A partir des biopsies de deux SR, les premiers résultats montrent que les cellules CD3-/TCR- et les cellules d'un clone T autologue partagent un gène  identique, ce qui confirme que les cellules CD3-TCR- sont bien issues d'un clone T + activé. De plus, les séquences des gènes  issus des T de deux biopsies de SR révèlent la présence de mutations ponctuelles dans les régions variables et jonctionnelles de ces gènes. La fréquence et la nature de ces mutations dans les populations oligoclonales de l'intestin de ces patients ainsi que dans l'intestin normal (moins fréquentes) suggèrent fortement un mécanisme d'hypermutation somatique comparable à celui des gènes des Ig, ainsi qu'une sélection des cellules T sur l'affinité antigénique. Ces résultats peuvent en partie expliquer la perte d'expression du TCR dans un site de stimulation antigénique tel que l'intestin. Elle peut être liée à l'activation des clones et l'hypermutation illégitime dans la région régulatrice du TCR permettant ainsi aux cellules d'échapper au programme d'apoptose, de proliférer lentement et de s'accumuler dans le temps.

Réponse des souris C57BL/6 au toxoplasme. Dominique Buzoni-Gatel

Les souris C57BL/6 développent une ileite aiguë après infection orale avec des kystes de Toxoplama gondii. Cette pathologie n'est pas due à une mutiplication intempestive du parasite mais à une réaction immunitaire innée et adaptative incontrôlée. Nous avons utilisé une souche mutante de Toxoplasme dépourvue de l'expression de SAG1, protéine majeure de surface du parasite et montré que SAG1 est responsable de la réponse immune exacerbée. En effet, les enterocytes et les cellules dendritiques infectés par le mutant produisent respectivement de faibles quantités de chemokines pro-inflammatoires et d'IL-12. La faible stimulation de ces cellules conduit à un défaut d'activation des lymphocytes CD4 de la lamina propria et donc à leur sécrétion amoindrie d' IFN- et de TNF-. Chez les souris infectées par la souche parentale, les lymphocytes intra épithéliaux de l'intestin par la production de TGF- tentent de maintenir l'homéostasie. Ils agissent directement sur les lymphocytes de la lamina propria en régulant leur production d'IFN- par le biais des pathways T-Bet et Smad. Les IELs sont attirés dans l'intestin infecté grâce à l'interaction des chemokines MIP-1,  avec leur récepteur CCR-5. Nos projets s'orientent vers l'analyse du rôle des cellules dendritiques dans la pathologie intestinale ainsi que dans le transport du parasite de l'intestin au cerveau

Immunité antitumorale. Laurent Ferradini

Le projet du groupe d'immunologie des tumeurs présente deux axes de recherche centrés sur l'étude du mélanome malin. Le premier axe concerne l'analyse de la réponse antitumorale au cours du mélanome chez l'homme en se concentrant sur l'analyse des réponses T CD4+ spécifiques d'antigènes mélanocytaires grâce à l'utilisation de tétramères MHC de classe II, et la détection de cellules T régulatrices CD4+ CD25+ dans des lésions métastatiques. Ces études sont faîtes dans le cadre d'un protocole de recherche clinique élaboré en collaboration avec les services de Dermatologie et d'Anatomo-Pathologie de l'Hôpital Saint-Louis (CCPPRB n° 2001/51). Nous participons aussi au suivi immunologique quantitatif de réponses T spécifiques chez des patients traités par immunothérapie à Nantes. Le deuxième axe de recherche de notre groupe a pour but de développer un modèle murin de croissance tumorale in vivo, situation de développement tumoral plus physiologique que les modèles utilisés jusqu'à présent. Nous disposons actuellement d'un modèle de mélanome murin inductible in vivo par le système Tet-on qui devrait nous permettre d'étudier la réponse antitumorale contre un antigène tumoral " modèle " (GP-LCMV) lui-même inductible introduit par transgénèse. Ce modèle devrait constituer un outil approprié pour identifier les mécanismes d'immunosurveillance impliqués dans le mélanome, pour l'étude du rôle du microenvironnement tumoral (abordé par analyse du transcriptome après microdissection dans le cadre du programme CIT de la Ligue Contre le Cancer), ainsi que pour l'évaluation de nouvelles approches d'immunointervention.

Physiopathologie des cellules NKT. Gabriel Gachelin

Le groupe a poursuivi sa recherche sur la physiologie des cellules NKT et les effets du ligand reconnu par leur TCR, l'alpha-galactosyl-ceramide et ses dérivés présentés par l élément de restriction CD1d1. L'usage de dérivés fluorescents de l'alpha-galactosyl ceramide a montré que ces molécules étaient très rapidement absorbées par les macrophages et par les cellules de Kupffer. Nous avions démontré précédemment que les cellules NKT sont attirées très précocément et de manière indépendante de l'antigène, sur les sites de réactions inflammatoires aigues induites par divers ligands glycolipidiques. Il a été démontré cette année que leur migration hors du sang et du foie vers ces sites était indépendante de la présence de la molécule CD1d1. Cette migration est largement dominée par le rôle du couple IP10/CXCR3 la production d'IP1O étant très fortement stimulée par l'IFNg relâché sur le site inflammatoire dans le contexte Th1 que nous étudions. Les profils d'expression des récepteurs de chimiokines sont très différents selon les populations de NKT qui se trouvent dans différents organes et selon leur phénotype DN ou CD4+ . L'étude de la réponse des NKT intra-hépatiques , très spécifiquement l'induction de leur apoptose, à l'injection d'alpha galactosyl ceramide a montré que ce phénomène, ainsi que le développement de la réaction inflammatoire locale, était totalement indépendant de l'expression de CD1d1 tandis que la présence de NKT était en revanche nécessaire à la sécrétion de facteurs responsables du recrutement de neutrophiles, de macrophages et de cellules dendritiques dans le foie exposé à ce réactif. L'ensemble de ces données suggère une absence de rôle de CD1d1 à dans la physiologie des NKT à la périphérie, tandis que son rôle comme élément de sélection positive intrathymique était très largement vérifié. Tout se passe comme si il existait une sorte de découplage entre la modalité de sélection de ces cellules et la modalité d'action à la périphérie.

Origine des lymphocytes intra épithéliaux Delphine Guy-Grand

Chez les souris nude, exprimant un transgène GFP sous contrôle du promoteur de RAG2, des lymphocytes fluorescents peuplent la médullaire des ganglions mésentériques.

En l'absence de thymopoièse, chez les souris nude, des lymphocytes T se différencient ; ils sont nombreux dans l'épithélium de la muqueuse intestinale. L'ontogénie de cette différenciation extrathymique et son importance relative chez les souris euthymiques étaient controversées. Par l'étude de souris portant un transgène exprimant la protéine fluorescente GFP sous le contrôle du promoteur de RAG2, nous avons montré que l'activité de cette recombinase s'exerçait chez les souris sans thymus dans des lymphocytes logés dans la médullaire des ganglions mésentériques et à un degré moindre dans les plaques de Peyer. Cette lymphopoièse suit des étapes ontogéniques proches de celles de la thymopoïèse (la recombinase s'exprimant dans les "double négatives", CD25CD44, et les "double positives"). Cependant, la différenciation en lymphocytes TCR apparaît favorisée tandis que la sélection positive des lymphocytes TCRsemble défectueuse, ne générant qu'un nombre restreint de cellules dont le répertoire est oligoclonal. Cette lymphopoïèse ne s'observe pas au niveau des cryptoplaques (formations lymphoïdes muqueuses considérées comme site de précurseurs des lymphocytes intraépithéliaux (LIE)). Les LIE ne sont pas fluorescents et n'ont donc pas subi in situ les processus de recombinaison ; ils proviennent de précurseurs mésentériques migrant à travers le canal thoracique. Fait remarquable, chez les souris euthymiques la différenciation extrathymique apparaît totalement réprimée sauf en conditions pathologiques de déplétion lymphocytaire sévère (souris irradiées, agées ou génétiquement déficientes en lymphocytes TCR). Ainsi, chez la souris normale, les LIE (y compris les LIE CD8) ont une origine thymique.

Répertoire des cellules B.. François Huetz

La maintenance et la stabilité du répertoire des cellules B à la périphérie, dans les organes lymphoïdes secondaires et dans le sang circulant suscitent de nombreuses interrogations sur les mécanismes qui sont mis en jeu pour les réaliser. Le fait que l'ensemble des cellules constituant ce répertoire soit rapidement renouvelé par un apport cellulaire constant de la moelle osseuse suggère une organisation particulière du répertoire des cellules B périphériques pour pouvoir répondre rapidement à un antigène donné et conserver la mémoire de ces réponses. Paradoxalement, les caractéristiques du répertoire des cellules B sont mal connues en conditions physiologiques. Cette constatation nous a conduit à adapter la méthode de l'Immunoscope aux cellules B en y associant une détermination quantitative de l'usage des différentes familles de gène VH et JH par PCR en temps réel (Taqman) et au séquençage exhaustif des réarrangements d'intérêts. Les résultats obtenus montrent que le répertoire des chaînes lourdes des lymphocytes B est plus diversifié d'environ un ordre de grandeur que celui des chaînes Vß du récepteur (TCR) des lymphocytes T. Une estimation de la contribution des mutations somatiques à la diversité du répertoire des lymphocytes B a été effectuée, elle serait proche d'un facteur 2. On peut en déduire que la taille des clones B circulants est proche de 1 et donc en première approximation, chaque cellule B circulant dans le sang est unique, à l'exception de celles qui ont subi une expansion clonale. Nos premiers résultats montrent que pour un réarrangement présentant une distribution gaussienne des régions CDR3, la proportion d'expansions clonales d'un donneur adulte serait voisine de 20 %.

Ces données nous permettre d'envisager un mode de fonctionnement des lymphocytes B périphériques différent de celui des cellules T. Un lymphocyte B d'une spécificité donnée serait pratiquement unique ce qui implique un mode de recrutement et d'activation probablement plus long que celui des lymphocytes T, suivi d'une prolifération clonale, qui serait alors dans le sang circulant, la signature d'une réponse contre l'antigène.

Etudes sur le répertoire des lymphocytes T. Jean Kanellopoulos

Dans le prolongement direct de nos travaux antérieurs, nous étudions, chez la souris, les répertoires des lymphocytes T chez les souris déficientes en déoxynucléotidyl transférase terminale.

Etude du répertoire des lymphocytes T de souris TdT°/° en réponse à des antigènes protéiques présentés par les molécules de classe I ou II du CMH.

Nous avons récemment montré que la taille du répertoire  est diminuée de 15 à 20 fois chez les souris TdT°/° par rapport aux souris TdT+/+. Par ailleurs, il est bien établi que ces souris ne sont pas immunodéficientes et résistent à de nombreux agents pathogènes.

Afin d'étudier de façon plus fine le répertoire des souris TdT °/°, nous avons comparé les réarrangements  et  des TcR sélectionnés par des antigènes protéiques chez les souris C57Bl/6 et C57BL/6 TdT°/°. Pour cela, nous isolons les cellules T spécifiques d'un épitope bien défini à l'aide de peptides-tétramères classe I ou classe II du CMH. Les réarrangements V des lymphocytes T sont ensuite séquencés et comparés. Nos résultats montrent que les souris TdT°/° possèdent un répertoire V publique comparable à celui des souris TdT+/+. Nous avons analysé l'évolution du répertoire en réponse secondaire. Nous avons donc mesuré la maturation d'avidité des lymphocytes T spécifiques au cours des réponses secondaires contre le peptide immunodominant de la nucléoprotéine du virus de l'influenza. Ceci a été obtenu en mesurant les cinétiques de dissociation des tétramères H-2Db-NP 366-374 spécifiques. Nous avons observé que les souris déficientes comme les souris TdT+/+ présentent une maturation d'avidité au cours des réponses secondaires bien qu'elles ne modifient pas les séquences V de leur TcR. Nous voulons déterminer si cette maturation d'affinité est due à une modification des réarrangements V ou à des mécanismes compensateurs tels qu'une augmentation du nombre de co-récepteurs des lymphocytes T permettant l'émergence de populations cellulaires de forte avidité.

Etude du répertoire des lymphocytes T de souris TdT °/° et TdT+/+ en réponse à la protéine encéphalitogène MOG

Il a été démontré que l'introduction de la déficience en TdT dans les souches de souris qui développent spontanément des maladies auto-immunes, avait un effet protecteur et entraînait une diminution de la pathologie auto-immune. Afin d'étudier ce phénomène dans un modèle expérimental qui permette une analyse précise des populations T spécifiques d'un auto-antigène défini, nous avons immunisé les souris TdT +/+ et TdT°/° par la protéine recombinante MOG soluble (ce travail est fait en collaboration avec le Dr Danielle Pham Dinh et Cécile Delarasse). Nous comparons le répertoire  des lymphocytes T infiltrant le cerveau des animaux atteints d'encéphalomyélite expérimentale auto-immune. Le devenir des lymphocytes T spécifiques des épitopes de MOG sera étudié au cours des poussées évolutives et des rémissions de la maladie grâce à des oligonucléotides clonotypiques.

Initiation d'une étude de l'immunité innée dans le modèle Danio rerioJean Pierre Levraud

Le danio zébré (Danio rerio, zebrafish en anglais) est devenu un modèle populaire en embryologie, en raison de l'excellente accessibilité de son embryon à l'observation microscopique et des outils génétiques désormais disponibles.

Nous nous sommes récemment intéressés au danio zébré pour l'étude de l'immunité innée. Un des intérêts particuliers de ce modèle réside dans la possibilité d'observer directement les interactions in vivo entre les pathogènes et les cellules de l'hôte. En particulier, nous nous intéressons aux macrophages précoces, premiers leucocytes qui apparaissent dans l'embryon.

En collaboration avec Philippe Herbomel (Unité de Génétique des Déficits Sensoriels), nous avons entrepris de caractériser les voies de signalisation utilisées par les macrophages précoces de l'embryon du danio au cours d'une infection expérimentale. Dans un premier temps, nous nous sommes focalisés sur la voie TLR/Myd88. Après avoir caractérisé les homologues de ces gènes chez le danio, nous cherchons à savoir si cette voie est impliquée dans la reconnaissance et l'éradication de bactéries non pathogènes E. coli ou B. subtilis, par des expériences d'inactivation génique à l'aide d'oligonucléotides antisens (" morpholinos "). Cette thématique sera ensuite étendue à des pathogènes, tels que Mycobacterium marinum.

Par ailleurs, nous développons de nouveaux moyens d'investigation microscopique in vivo. Notre but est notamment d'obtenir des poissons transgéniques qui expriment des molécules photoactivables permettant un suivi à volonté de cellules individuelles, ou dont tous les macrophages sont fluorescents. Par ailleurs, nous élevons des poissons dépourvus de tout pigment, afin d'étendre ce type d'analyse microscopique in vivo chez le poisson adulte.

Analyse des populations de lymphocytes T mémoire et effectrices et étude des bases moléculaires de leur phénotype. Christophe Pannetier

La station de suivi de la réponse immunitaire T cytotoxique, développée avec le soutien de la Ligue contre le Cancer, a été validée dans le cadre d'un essai clinique d'immunothérapie du mélanome dirigée par la société IDM Dans la perspective d'étudier l'impact d'une pathologie tumorale ou des traitements anticancéreux sur le compartiment des lymphocytes T mémoire CD8+, l'étude du répertoire de ces lymphocytes a été poursuivie chez des donneurs sains. Les sous-répertoires des populations CD62L+ et CD62L- ont été ainsi caractérisés et leur évolution au cours du temps a été étudiée. Les propriétés de ces populations sont maintenant étudiées chez la souris.

En collaboration avec le laboratoire d'immunologie du NIAID, et l'unité INSERM U345, et avec le soutien de l'ACI " Biologie du développement et physiologie intégrative ", l'étude visant à localiser les changements de l'état de méthylation dans le génome survenant au cours de la différenciation des lymphocytes T naïfs murins en cellules T mémoire a été poursuivie. La méthode RLGS-M utilisée (voir photo) a permis de repérer plusieurs marqueurs génétiques identifiant des régions différentiellement méthylées entre ces deux populations. Pour réaliser le clonage de ces marqueurs, un logiciel et une base de donnée ont été développés, qui permettent de réaliser des gels RLGS-M in silico en exploitant la séquence du génome de la souris.

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