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Version PDF      Biologie Moléculaire de l'Expression Génique


  Responsable : Israël Alain (aisrael@pasteur.fr)


  resume

 

Les projets du laboratoire portent sur l'étude de deux systèmes de signalisation caractérisés par des événements inductibles de protéolyse, aboutissant au transport nucléaire de facteurs de transcription. Un premier projet concerne la famille de facteurs de transcription rel/NF-kB, dont l'activité est contrôlée par des mécanismes de rétention cytoplasmique impliquant des molécules inhibitrices (appelées IkB) dont la dégradation est induite par une variété de signaux. Nous avons identifié plusieurs pathologies causées par des mutations dans un gène codant le composant central de cette voie de signalisation (la protéine NEMO). Nous avons d'autre part mis au point un système permettant de disséquer les diverses étapes de l'activation de NF-kB par le récepteur à l'antigène des cellules T. Parallèlement à ces études nous avons généré des souris où une ou plusieurs des molécules inhibitrices IkB ont été invalidées, ainsi que d'autres où l'activité NF-kB a été spécifiquement inhibée dans certaines régions du cerveau.

Un second projet porte sur le récepteur Notch qui transmet un signal à la suite de 3 étapes de protéolyse et du transport nucléaire de sa région intracellulaire. Nos efforts ont porté dans 3 directions : nous avons tout d'abord identifié un mécanisme de contrôle de l'activité Notch qui implique la dégradation de la forme nucléaire de ce récepteur. Nous avons ensuite identifié un nouveau mécanisme qui par l'intermédiaire d'une modification post-traductionnelle du produit de la seconde étape de protéolyse permet à la troisième d'avoir lieu. Finalement nous avons caractérisé la coupure d'un ligand de Notch par une métalloprotéase et construit une forme de ce ligand qui ne peut être coupée.



  rapport

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Analyse génétique et biochimique des voies d'activation des facteurs de transcription NF-kB (G. Courtois, R. Weil, A. Kovalenko, R. Blaise, L. Arbibe, A. Lilienbaum, C. Bessia)

En collaboration avec le groupe de JL Casanova (hopital Necker), nous avons montré que des mutations hypomorphes dans le gène codant NEMO, la sous-unité structurale/régulatrice du complexe IKK qui joue un rôle central dans la voie de signalisation NF-kB, se traduisent chez les patients mâles par une série de symptomes incluant en particulier un déficit de l'immunité innée et un syndrome appelé DEA (dysplasie ectodermale anhidrotique). Un nouveau patient portant une mutation dans un autre composant de la voie d'activation a été identifié : contrairement aux patients précédents il présente un déficit en cellules T mémoires.

Parallèlement nous avons entrepris une étude détaillée de l'activation de NF-kB par la voie du TCR. Nous avons tout d'abord montré que le complexe IKK était recruté au niveau de la synapse immunologique, puis en utilisant des cellules mutées dans divers constituants de la voie du TCR nous avons montré que le recrutement de NEMO au TCR était suffisant pour activer NF-kB. Finalement nous avons montré que le simple ciblage de NEMO à la membrane plasmique suffisait à activer NF-kB, et ceci indépendamment de sa localisation dans les rafts. Ce système devrait nous permettre de fractionner le mécanisme d'activation de NF-kB par le TCR en modules indépendants, et d'étudier séparément les événements NEMO-dépendants et NEMO-indépendants.

Finalement une étude portant sur des neurones de cervelet en culture a permis de caractériser les voies de signalisation responsables du niveau de base d'activité NF-kB dans ces cellules, et de démontrer le rôle critique du niveau de calcium intracellulaire.

Analyse de l'activité NF-kB in vivo (S. Mémet, D. Ndiaye)

La construction de souris déficientes en deux inhibiteurs, IkBa et IkBe, a montré un phénotype nettement plus sévère que celui des souris simple KO : ces animaux meurent à la naissance et montrent une activité NF-kB augmentée, associée à une augmentation de l'expression de certains gènes-cibles. L'analyse des cellules lymphoïdes à E18,5 montre un déficit en cellules B matures, dû à une apoptose massive des cellules progénitrices. Des expériences de reconstitution dans des souris-hôtes ont identifié un rôle inattendu de NF-kB dans la migration des cellules B et T vers les organes lymphoïdes secondaires. Ces résultats confirment le rôle central de NF-kB dans l'homéostasie et la survie des lymphocytes, et suggérent qu'un déficit aussi bien qu'une augmentation de NF-kB peuvent induire des dysfonctionnements semblables.

En parallèle une approche permettant d'exprimer de manière inductible l'inhibiteur IkBa dans le cerveau antérieur a été entreprise. L'étude des neurones de ces souris a permis de confirmer pour la première fois dans un système in vivo le rôle anti-apoptotique de NF-kB dans ce type cellulaire.

La voie de signalisation Notch (F. Logeat, C. Brou, N. Gupta, E. Six, A. Olry, D. Ndiaye, O. LeBail)

Nous avons proposé un modèle selon lequel l'activation du récepteur Notch implique 3 étapes de maturation protéolytique. La première coupure est dûe à la furine et est nécessaire à l'expression à la membrane d'un récepteur fonctionnel. Une seconde étape de coupure, nécessaire à l'activation et localisée dans la région extracellulaire, a été caractérisée. L'enzyme responsable a été identifiée, du moins dans certains tissus, comme étant TACE, une métalloprotéase impliquée dans la maturation du TNF. L'étape finale est dûe à une activité nommée g-secrétase, et aboutit à la libération de la région intracellulaire du récepteur qui est transportée dans le noyau où elle se comporte comme un co-activateur transcriptionnel. Nous avons récemment montré que l'activité de cette molécule est contrôlée par la voie ubiquitine-protéasomes : à la suite d'une étape de phosphorylation nucléaire, elle est reconnue spécifiquement par une ubiquitine-ligase nommée SEL-10, aboutissant ainsi à sa dégradation par le protéasome.

Nous nous sommes d'autre part intéressés à la troisième étape de protéolyse dûe à l'activité g-secrétase. Nous avons d'une part démontré que cette étape de clivage requérait une modification de son substrat, le produit de la seconde coupure, probablement nécessaire au transport de ce produit vers le site de coupure par la troisième activité. Nous avons d'autre part mis au point un crible génétique permettant d'isoler des cellules ayant perdu l'activité g-secrétase, et qui devrait nous permettre d'identifier de nouveaux composants du complexe responsable de cette activité, ou de nouveaux régulateurs de cette activité.

Finalement nous avons caractérisé l'événement de coupure protéolytique responsable de la formation d'une forme soluble du ligand Dll1. Nous avons identifié le site de coupure et construit une forme mutée de ce ligand résistante à ce clivage, ce qui devrait nous permettre de mieux comprendre à la fois le rôle de la coupure et celui de la forme soluble.

Mots-clés: Signalisation, phosphorylation, protéolyse, ubiquitination ; NF-kB, Notch



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Marie Dominique Aytac (mdaytac@pasteur.fr) COURTOIS, Gilles, INSERM (DR2)

LOGEAT, Frédérique, CNRS (DR2)

BROU, Christel, Institut Pasteur (CR)

MEMET, Sylvie, INSERM (CR1)

WEIL, Robert, CNRS (CR1)

ARBIBE, Laurence, INSERM (CR1)
BLAISE, Régis, post-doc

GUPTA, Neetu, post-doc

KOVALENKO, Andrew, post-doc

SIX, Emmanuelle, thésarde

OLRY, Annie, étudiante DEA

LOPEZ, Tatiana (technicienne Pasteur)

NDIAYE, Delphine (AI CNRS)

MOURGUIN-NAGUIN Stéphanie, agent de laboratoire

BESSIA, Christine (technicienne Pasteur)

LEBAIL, Odile (Ingénieur Pasteur)

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