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Version PDF      Biologie Moléculaire du Développement - URA 1947 du CNRS


  Responsable : Jean-François NICOLAS (jfnicola@pasteur.fr)


  resume

 

Le contrôle des comportements cellulaires (modes de croissance, modes de division et modes de dispersion) est un des aspects fondamentaux du développement des vertébrés. En effet, leur coordination permet la formation de territoires transitoires embryonnaires à partir desquels les signalisations inter-cellulaires peuvent se déployer et de diversifier. Ce sont ces aspects du développement que nous étudions. Pour en comprendre les fondements nous comparons plusieurs systèmes modèles de vertébrés. Ces études passent par l'analyse clonale (système LaacZ) et l'imagerie. Nous sommes aussi intéressés par l'impact sur l'expression génique des modifications épigénétiques (propres aux vertébrés) qui sont apposées en cis sur le génome à des moments clés du développement.



  rapport

cale

Modification épigénétique du génome au cours du développement

L'examen des lignées de souris transgéniques EF1a LacZ, EF1a LagZ et EF1a LagoZ (établies précédemment dans le laboratoire) dans lesquelles les gènes rapporteurs LacZ, LagZ et LagoZ sont plus ou moins riches en CpG s'est poursuivi au niveau moléculaire. Les patterns de méthylation des gènes rapporteurs et du promoteur (qui correspond à un îlot riche en CpG) pour les tissus somatiques et pour la lignée germinale ont été soigneusement établis. Leur comparaison nous permet de proposer un modèle qui rend compte des phénomènes d'extinction d'expression : les régions riches en CpG des gènes LacZ et LagZ interfèreraient avec le processus de protection de l'îlot CpG EF1a au moment de la méthylation de novo de l'ADN du génome, à l'implantation de l'embryon (E5,5 — E6,5). Il s'ensuivrait un changement d'orgaisation de la chromatine de la région promotrice incompatible avec l'expression.

Analyse clonale

L'exploration clonale du système musculaire et du système nerveux central s'est poursuivie. La méthode utilisée, mise au point auparavant par le laboratoire, consiste à marquer génétiquement une cellule de l'embryon et à analyser le clone qu'elle produit à un moment précis du développement. Ceci nécessite l'utilisation de lignées de souris transgéniques pour un gène rapporteur particulier appelé LaacZ. La production de librairies de plusieurs centaines de clones permet ensuite de décrire en détail les comportements cellulaires (Figure 1).

Pour ce qui concerne le système musculaire, l'analyse des clones dans les 40 segments qui ensemble constituent le myotome dans l'embryon à E11,5 a révélé que (1) le groupe de cellules précurseurs ne s'organise en deux compartiments clonaux, médian et latéral, que juste avant la production de ces segments et que (2) durant cette production, une relation topographique directe est conservée entre groupe producteur et segment myotomal. Ces constatations permettent une interprétation nouvelle des patterns d'expression des gènes du développement dans ces structures.

Plus tôt dans l'histoire des précurseurs du système musculaire, durant la formation du tronc (axiogenèse), les cellules suivent un comportement dit cohérent (peu de mouvements et peu de divisions) bien que l'embryon s'allonge considérablement. Ce comportement cohérent concerne les axes antéro-postérieur et dorso-ventral. Il est établi avant la bilatéralisation des structures du tronc de l'embryon. Comme c'est durant cette période que les cellules sont soumises aux signaux moléculaires qui déterminent la segmentation et fixent l'identité de position antéro-postérieure (horloge moléculaire et activation des gènes Hox), ces analyses suggèrent comment le contrôle du comportement cellulaire durant cette période s'organise en fonction des contraintes engendrées par ces systèmes moléculaires (Figure 2). Le mode de production des précurseurs du myotome à partir d'un groupe de cellules qui s'auto-maintient dans une structure permanente, l'organisation spatiale des cellules dans ce groupe et la production synchrone des contributions droite et gauche de composition clonale identique sont autant d'éléments sur lesquels (et peut-être même à partir desquels) s'élaborent les systèmes moléculaires de la segmentation et de l'acquisition d'une identité de position AP.

Enfin, pour aborder l'étude de la mise en place du système musculaire définitif, deux nouvelles librairies de 1200 clones ont été produites dans l'embryon à E14,5 et dans le souriceau à P7 à partir des souris " LaacZ-muscle ".

Pour ce qui concerne le système nerveux central, l'analyse de clones neuronaux (obtenus à partir des souris " LaacZ-nerf) dans le télencéphale et dans le cervelet s'est poursuivie.

Nouveaux systèmes, nouveaux organismes

Les potentialités d'une nouvelle méthode de marquage des cellules dans l'embryon ont été explorées. Dans cette méthode, les marquages sont induits temporellement. On exploite ici les propriétés d'une recombinase (la Cre du bactériophage P1) fusionnée à un récepteur aux oestrogènes muté. La lignée rapporteur ne présente pas de restrictions d' expression. Cette méthode nous a permis de produire des librairies de clones induits dans l'ectoderme de surface à E12,5 et dans l'épiderme et ses dérivés (Figure 3 ). Leur analyse devrait révéler les propriétés (position, mode de production et potentialités) des cellules-souches du tégument et leur relation avec les cellules embryonnaires.

Enfin, pour aborder expérimentalement certains problèmes d'embryologie comparative entre vertébrés, une petite structure d'élevage de poissons-zèbre et une unité d'électroporation d'embryons de poulets ont été mises en place.

Figure 1 :: Système LaacZ de marquage des clones. A) Le gène rapporteur nls LaacZ. Un gène rapporteur nls LaacZ dans lequel une duplication a rendu l'enzyme inactive est lié à un promoteur musculaire spécifique, spécifique, MSP. Une recombinaison homologue spontanée entre les séquences dupliquées " aa " réétablit la structure b-galactosidase codante. B) Production de clones dans la progénie d'un croisement entre un mâle transgénique LaacZ et une femelle de type sauvage. Pendant le développement, une recombinaison homologue spontanée se produit entre les séquences dupliquées de LaacZ créant de ce fait un gène fonctionnel LacZ dans la cellule. Cet événement amorce le marquage clonal (coloration en bleu) dans l'embryon. Dans la lignée transgénique a-2, la fréquence des clones myogéniques b-gal+ à E11.5 est de 5x10-2 par embryon.

Figure 2 : Modèle d'organisation du pool de précurseurs du myotome dans la ligne primitive. La partie postérieure est en haut ; la partie antérieure est en bas. La ligne primitive (PS) : le mésoderme présomitique (PSM) et les somites (S), puis le dermomyotome (D) et le myotome (M) sont représentés indépendamment des structures adjacentes. Le pool de cellules à capacité d'auto-renouvellement impliqué dans l'axiogenèse est localisé dans la ligne primitive. Le gradient de couleurs représente la régionalisation antéro-postérieure. Les cellules les plus antérieures (cercles noirs) contribuent à la partie intermédiaire du mésoderme paraxial, du mésoderme présomitique au dermomyotome et au myotome (flèches noires). Les cellules plus postérieures (cercles ouverts) contribuent à la partie plus latérale du mésoderme paraxial (flèches blanches). Cela aboutit à une réorientation de l'axe d'AP à ML, symbolisé par le changement d'orientation du gradient. La persistance de la régionalisation établie dans la ligne primitive jusqu'à la formation du dermomyotome et du myotome est schématisée par la continuité du gradient dans ces structures. Noter la symétrie du gradient entre les parties gauche et droite du mésoderme paraxial. Les cellules intermédiaires dans le pool de cellules à capacité d'auto-renouvellement (cercles noirs et ouverts) contribuent bilatéralement au mésoderme paraxial (flèches noire et blanche) et les cellules les plus latérales (cercle gris) contribuent uniquement au côté où elles sont localisées (flèche grise). La séparation clonale entre les parties médiale et latérale des somites (lignes verticales épaisses) qui persiste dans le myotome est surimposée à la régionalisation médiolatérale du mésoderme paraxial établi dans le pool de cellules à capacité d'auto-renouvellement dans la ligne primitive. A, antérieur ; P, postérieur ; l, latéral ; m, médial ; PS, ligne primitive ; PSM, mésoderme présomitique ; S, somite ; D, dermomyotome ; M, myotome.

Figure 3 : Marquages LacZ induits temporellement. A. Induction du marquage à E8,5, observation dans l'embryon six jours après, vue dorsale : croissance orientée des cellules de l'ectoderme de surface. B. Induction du marquage à E13,5, observation des follicules pileux 340 jours après. Cette expérience démontre que le renouvellement des follicules pileux nécessite le recrutement de plusieurs cellules-souches d'origines clonales différentes.

Mots-clés: LaacZ , lignage cellulaire , embryon de souris , analyse clonale , système musculaire , système nerveux central , méthylation d’ADN , CpG , épigénétique , LagoZ , biologie du développement



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  Françoise kamel, IP (fkamel@pasteur.fr) NICOLAS, Jean-François, DR1 INSERM (jfnicola@pasteur.fr)

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Sylvie FORLANI, stagiaire post-doctorale (sforlani@pasteur.fr)

Sophie ELOY-TRINQUET, stagiaire post-doctorale (eloytrin@moka.ccr.jussieu.fr)

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Emilie LEGUE, stagiaire de doctorat (elegue@pasteur.fr)

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Christine MARIETTE, technicienne supérieure IP (mariette@pasteur.fr)

Suzanne CAPGRAS, technicienne, IP (scapgras@pasteur.fr)

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