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Version PDF      Biochimie des Interactions macromoléculaires


  Responsable : LADANT Daniel (ladant@pasteur.fr)


  resume

 

Le laboratoire étudie les mécanismes moléculaires qui gouvernent les interactions protéine-protéine et les interactions protéine-membrane en utilisant comme système modèle une toxine bactérienne, l'adénylcyclase (AC ou CyaA) produite par Bordetella pertussis, l'agent de la coqueluche. Les connaissances fondamentales concernant les mécanismes d'entrée de la toxine AC dans les cellules cibles et son interaction avec divers effecteurs cellulaires sont exploitées pour différentes applications en vaccinologie et biotechnologie.



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1 - Etude des mécanismes d'entrée de la toxine CyaA dans les cellules cibles (Cécile Bauche)

L'adénylcyclase sécrétée par B. pertussis possède la capacité de pénétrer dans les cellules eucaryotes cibles où, activée par la calmoduline (CaM), elle synthétise activement de l'AMP cyclique et ainsi altère le métabolisme cellulaire. L'AC est constituée d'un polypeptide de 1706 acides aminés : l'activité catalytique calmoduline-dépendante est localisée dans les 400 premiers acides aminés. La partie C-terminale de 1300 résidus environ est responsable de la liaison avec les cellules cibles et de la translocation du domaine catalytique N-terminal à travers la membrane cytoplasmique de ces cellules. Notre objectif est d'élucider les mécanismes moléculaires responsables de la translocation de la toxine AC dans les cellules cibles. Cette toxine possède en effet la propriété tout à fait originale de pouvoir délivrer son domaine catalytique N-terminal dans le cytoplasme des cellules cibles directement à travers leur membrane cytoplasmique. Nos travaux récents ont été consacrés à la caractérisation du rôle du calcium, un effecteur essentiel pour la translocation. CyaA en effet fixe de nombreux ions calcium sur des motifs dits RTX, localisés dans la partie C-terminale de la toxine. Différents fragments du domaine RTX ont été produits et caractérisés fonctionnellement et structuralement par spectroscopie de fluorescence et de dichroïsme circulaire (en collaboration avec A. Chaffotte, Unité de Repliement et Modélisation des Protéines, Institut Pasteur). Nous avons pu ainsi préciser les changements structuraux, induits par le calcium, qui préludent à la translocation de la toxine dans les cellules cibles.

2 - Ingénierie de toxines CyaA recombinantes pour la vectorisation d'antigènes in vivo. (Cécile Bauche ; en collaboration avec C. Leclerc, Unité de Biologie des Régulations Immunitaires, Institut Pasteur)

Parallèlement nous avons poursuivi nos travaux dans le domaine de l'ingénierie de toxines CyaA recombinantes d'intérêt vaccinal, une thématique développée depuis plusieurs années en collaboration très étroite avec C. Leclerc et son équipe (Institut Pasteur). Nous avions antérieurement montré que la toxine CyaA constitue un système vecteur d'antigène non-réplicatif très efficace pour induire des réponses immunitaires à médiation cellulaire. Nous avons récemment démontré que, in vivo, CyaA est délivrée de façon très efficace aux cellules dendritiques via une interaction spécifique avec l'intégrine CD11b/CD18, identifiée précédemment comme un récepteur de la toxine : ainsi des antigènes génétiquement couplés à CyaA peuvent être introduits dans la voie conventionnelle de présentation des molécules de CMH I. Le ciblage de la toxine CyaA sur les cellules dendritiques in vivo explique probablement la remarquable efficacité de ce vecteur qui en l'absence de tout adjuvant induit des réponses CTL indépendantes de l'aide des cellules T, CD4+ et de CD40. Les travaux en cours sont focalisés d'une part, sur l'identification du ou des sites d'interaction de CyaA avec son récepteur et d'autre part, sur la caractérisation immunologique de différentes toxines recombinantes portant des fragments d'antigènes viraux et/ou tumoraux.

3 - AC comme enzyme de signalisation chez Escherichia coli :élaboration de cribles génétiques pour la détection d'interactions protéine-protéine (Gouzel Karimova, Nathalie Dautin)

L'adénylcyclase de B. pertussis représente un modèle original d'enzyme bactérien activé par une protéine eucaryote, la calmoduline. Des travaux antérieurs avaient montré en particulier que le domaine catalytique (AC) est constitué de deux domaines complémentaires, appelés T25 et T18, (tous deux requis pour l'activité enzymatique). Nous avons exploité la structure modulaire de cet enzyme pour élaborer un crible génétique permettant, chez E. coli, de détecter des interactions protéine-protéine. Dans ce système dit " double-hybride bactérien" (DHB), des protéines d'intérêt sont fusionnées génétiquement aux deux domaines T25 et T18 et co-exprimées dans une souche d'E.coli Dcya. L'association des deux protéines hybrides permet une complémentation fonctionnelle entre les deux fragments de l'AC et restaure une activité enzymatique adénylcyclase, donnant lieu à une synthèse d'AMPc qui est un régulateur pléiotrope de l'expression génétique chez E. coli. Cette cascade d'activation peut être détectée par criblage sur des milieux indicateurs ou sélectifs appropriés. Au cours de l'année passée, nous avons montré que cette méthodologie est particulièrement appropriée pour analyser in vivo l'assemblage de protéines membranaires. Le système DHB a été utilisé, en particulier, pour étudier les associations entre différentes protéines membranaires d'E . coli impliquées dans la formation du septum de division cellulaire (protéines Fts). La fonction précise de la plupart est inconnue de même que les bases moléculaires responsables de leur assemblage. Les résultats d'analyse double-hybride ont révélée une multiplicité d'interactions entre ces différentes protéines Fts. L'objectif est maintenant de cartographier dans le détail, les domaines d'interactions spécifiques entre ces différents composants essentiels de la machinerie de division cellulaire.

4 - Système génétique de détection d'activité protéolytique chez E. coli : détection de la résistance de la protéase VIH aux drogues antiprotéases. (Nathalie Dautin, Sébastien Franconi)

La structure modulaire de l'adénylcyclase a également été exploité pour élaborer un test génétique pour détecter des activités protéolytiques site-spécifique. Ce test est fondé sur l'inactivation, par protéolyse spécifique, d'une AC modifiée dans laquelle un polypeptide correspondant au site de clivage de la protéase d'intérêt a été inséré entre les deux domaines T25 et T18. Dans une souche E. coli cya, l'inactivation de l'AC modifiée par la protéase co-exprimée, est révélée par un changement de phénotype (" Cya+ " -> " Cya- "), aisément visualisé sur des milieux indicateurs et/ou sélectifs appropriés. Cette technique a été développée en particulier pour détecter l'activité protéolytique de la protéase du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) et nous avions montré antérieurement que ce test est suffisamment sensible pour détecter des protéases du VIH résistantes aux drogues antiprotéase, utilisées dans les traitements anti-SIDA. Au cours de l'année passée, en collaboration avec F. Clavel (Hôpital Bichat, Paris) nous avons entrepris d'explorer les potentialité de ce test génétique rapide pour diagnostic phénotypique de la résistance du VIH aux antiprotéases.

5 - Répression catabolique chez E. coli. (Agnès Ullmann, Gouzel Karimova)

Ce projet représente la continuation des recherches des années 1970-80 de A. Ullmann. Nous avons isolé un mutant dont la régulation des opérons cataboliques est devenue cAMP-indépendante et leur expression n'est plus soumise à la répression catabolique. Deux mutations, non décrites jusqu'à présent, dans le gène de la protéine CAP (le récepteur de cAMP) sont responsables de ces effets.

Mots-clés: toxine, adénylcyclase, vectorisation, double-hybride, protéase, vaccinologie, biotechnologie



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
    KARIMOVA Gouzel, Institut Pasteur, Chargée de Recherche, karimova @pasteur.fr

LADANT Daniel, CNRS, DR2,ladant@pasteur.fr
BAUCHE Cécile, post-doc

DAUTIN Nathalie, étudiante en thèse

ULLMANN Agnès, DREM CNRS

FRANCONI Sébastien, technicien en CDD du 01/02/02 au 04/08/02
 

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