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Version PDF      Biologie du Développement - CNRS URA 1947


  Responsable : BABINET Charles (chbabi@pasteur.fr)


  resume

 

Notre laboratoire s'intéresse au développement embryonnaire de la souris. Trois voies de recherche sont poursuivies : 1) Le rôle des interactions nucléocytoplasmiques dans le développement préimplantatoire. 2) L'analyse de la fonction de certains gènes par mutagenèse dirigée in vivo et la recherche de gènes de développement grâce à la stratégie de piégeage de gènes dans les cellules ES. 3) La mise au point de stratégies plus efficaces de mutagenèse par recombinaison homologue (RH).



  rapport

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1. Clonage de la mutation Ovum mutant, entraînant la mort embryonnaire au stade blastocyste et dont l'expression dépend d'un effet parental (M. Cohen-Tannoudji)

La lignée DDK est porteuse d'une mutation létale conditionnelle, Ovum mutant, qui entraîne la mort des embryons au stade blastocyste et dépend d'un effet parental (syndrome DDK). Nous avons montré que le syndrome DDK a son origine dans une interaction entre un facteur cytoplasmique DDK contenu dans le zygote et le génome paternel étranger. Nous avons maintenant établi un contig complet de la région génétique contenant le locus Om à l'aide de chromosomes artificiels de levure et de bactéries. Les techniques de piégeage d'exons et d'hybridation/sélection de cDNA associés au séquençage de la région Om (collaboration avec le Centre National de Séquençage, Evry) nous ont permis d'identifier environ une cinquantaine de gènes. Deux d'entre eux apparaissent comme des candidats privilégiés pour jouer un rôle dans le syndrome DDK : en effet d'une part, ils sont exprimés dans l'ovocyte et le testicule, d'autre part ces gènes portent une mutation dans la lignée DDK et uniquement dans celle-ci parmi une quinzaine de lignées de souris de laboratoire et sauvages. Au surplus, nous avons créé par recombinaison homologue dans les cellules ES, des allèles nulles de ces gènes et montré que leur invalidation entraînait une léthalité embryonnaire. Ainsi, ces gènes ont un rôle essentiel dans le développement de l'embryon.

2. Analyse de la fonction des gènes HNF1b et Trapa

- Fonctions du gène HNF1b (J. Barra en collaboration avec le laboratoire de M. Yaniv, Institut Pasteur)

Nous avions montré que des embryons homozygotes pour une mutation nulle du gène HNF1b meurent aux alentours du jour 7 de la gestation et qu'un défaut de différenciation de l'endoderme viscéral en était la cause primaire. Nous avons poursuivi l'analyse par mutagenèse conditionnelle de la fonction du gène HNF1 b. Nous avons montré que l'absence de HNF1b dans les hépatocytes et les canaux biliaires entraîne l'absence de formation de canaux biliaires intrahépatiques et de la vésicule biliaire. Nous avons de plus identifié deux gènes qui jouent un rôle respectivement dans l'homéostasie biliaire et dans l'oxydation des acides gras et dont l'expression est éteinte en l'absence de HNF1b. Nous avons étendu nos observations sur l'inactivation spécifique de HNF1b dans l'épiblaste qui entraîne des défauts dans la morphogenèse du foie, du pancréas et du rein. Nous avons également montré que l'inactivation de HNF1b dans l'intestin primitif entraîne d'importants défauts dans le développement de cet organe. Nous avons entrepris une analyse moléculaire de ces anomalies en examinant, dans un premier temps, l'expression de différents marqueurs connus pour être impliqués dans ces phénomènes de différenciation et de morphogenèse.

- Analyse fonctionnelle d'une mutation d'insertion entraînant un défaut de morphogenèse cardiaque (J. Barra)

Nous avions obtenu par une approche de piégeage de gènes une mutation d'insertion entraînant à l'état homozygote une léthalité embryonnaire au cours de la deuxième moitié de la gestation. Nous avions montré que l'insertion du vecteur de piégeage s'était produite dans le gène Trapa code pour une sous-unité d'un complexe protéique associé au translocon. L'analyse plus approfondie du phénotype des embryons mutants a démontré qu'ils souffraient d'une anomalie de morphogenèse du cœur, impliquant en particulier une hypertrophie cardiaque et un grave défaut de septation, entraînant une communication interventriculaire. Nous examinons actuellement l'implication directe ou indirecte les cellules de la crête neurale cardiaque dans le phénotype observé.

3. Une approche en vue d'améliorer l'efficacité du ciblage génique (M. Cohen-Tannoudji)

Nous avons récemment mis au point une stratégie de modification du génome de la souris basée sur la stimulation des processus endogènes de réparation qui permet d'augmenter considérablement la fréquence de mutation par ciblage de gène dans un locus donné. Elle consiste à introduire dans le locus à cibler un site de reconnaissance de la méganucléase I-SceI. L'action de la méganucléase crée une cassure double brin qui stimule la recombinaison au locus avec une matrice de réparation. Sur la base de cette stratégie, nous cherchons à: i) perfectionner les méthodes de mutagenèse dirigée en introduisant des modifications programmées directement dans le génome du zygote sans passer par les cellules souches embryonnaires de souris. ii) réaliser des modifications génétiques ciblées dans des cellules somatiques grâce à cette méthodologie. iii) identifier un ou plusieurs sites permissifs pour l'expression ciblée de gènes impliqués dans le développement d'une pathologie ou d'agents thérapeutiques dans le cadre d'études de faisabilité de thérapie génique.

Dernièrement, nous avons développé un gène rapporteur, constitué de deux fragments du gène lacZ, interrompu par un site I-SceI. Le gène rapporteur n'est pas fonctionnel car il existe une région dupliquée de part et d'autre du site I-SceI. En coinjectant ce gène rapporteur avec une solution contenant la protéine I-SceI dans le pronucléus d'un oeuf fécondé, nous avons pu observer l'expression de la b-galactosidase dans un pourcentage significatif d'embryons. Nous cherchons par ailleurs à étendre ce résultat, qui témoigne d'une recombinaison extrachromosomique, au cas d'un gène rapporteur intégré dans le génome. Pour ce faire, nous avons introduit le gène rapporteur dans un site endogène via les cellules ES. Les souris obtenues à partir de ces cellules ES modifiées seront la source de zygotes porteurs du gène rapporteur dans lesquels sera injecté I-SceI. Ainsi pourra être évalué la stimulation in ovo d'une recombinaison intrachromosomique.

Activité de service (S. Rudinger)

L'unité a la responsabilité d'un service pour la création de souris transgéniques.

Mots-clés: Développement embryonnaire de la souris, cellules ES, HNF1b, Trapa, interactions nucléocytoplasmiques, mutagénèse ciblée, I-SceI



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  FLEURANCE Isabelle (ifleur@pasteur.fr) BABINET Charles, CNRS et IP, (DR1 et Pr,chbabi@pasteur.fr)

BARRA Jacqueline, IP, (CR,barraja@pasteur.fr)

COHEN-TANNOUDJI Michel, CNRS, (CR1, m-cohen@pasteur.fr)

ARTUS Jérôme, Doctorant

CORMIER Sarah, stagiaire postdoctorale

COUMAILLEAU Franck, Doctorant

KRESS Chantal (Ingénieur d'études,kerssova@pasteur.fr)

MESBAH Karim (Technicien supérieur de laboratoire,mesbahk@pasteur.fr)

RUDINGER Stéphanie (Technicienne supérieure de laboratoire,rudinger@pasteur.fr)

VANDORMAEL-POURNIN Sandrine (Technicienne supérieure de laboratoire,drinette@pasteur.fr)


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