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Version PDF      Biologie cellulaire du parasitisme - INSERM U-389


  Responsable : GUILLEN-AGHION, Nancy (nguillen@pasteur.fr)


  resume

 

L'amibe hématophage, Entamoeba histolytica est l'agent étiologique de l'amibiase, une maladie infectieuse intestinale responsable de 50 millions de cas cliniques et de près de 100 000 décès par an. Le parasite résidant dans le colon est doué de motilité, il envahit et détruit l'épithélium intestinal humain. L'objectif général de notre projet de recherche est d'élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués d'une part dans le mouvement de E. histolytica, et d'autre part dans son interaction avec les cellules humaines ou avec la matrice extracellulaire.



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Les remaniements du cytosquelette chez E. histolytica conduisent soit à la polarisation de l'amibe, qui possède alors un uroïde dans la partie postérieure et un pseudopode locomoteur dans la partie antérieure, soit à la formation de pseudopodes phagocytaires. La mise en place de ces appendices permet à E. histolytica de se déplacer et de phagocyter les cellules humaines. Nous espérons proposer un modèle de signalisation allant de la perception par l'amibe de son environnement tissulaire, à la transduction des signaux mettant en route le remodelage du cytosquelette parasitaire nécessaire à la motilité, et à l'interaction avec les cellules humaines et leur phagocytose.

1. Polarisation de E. histolytica pendant le mouvement, formation de pseudopodes et reponse chimiotaxique.E. Labruyère, S. Blazquez, G. Voigt en collaboration avec C. Zimmer et J.C. Olivo dans le PTR " Nouvelles approches pour l'étude de la polarisation moléculaire de cellules mobiles par analyse d'images quantitative " dirigé par A. Alcover.

L'analyse cellulaire, génétique et moléculaire de la polarisation des amibes et de la formation de pseudopodes a permis d'identifier plusieurs protéines régulatrices de l'activité du cytosquelette ; parmi elles, la kinase PAK connue pour son activité lors de changements morphologiques des cellules eucaryotes. A l'aide de souches exprimant différents domaines de PAK et d'une méthode d'analyse d'images quantitative mise au point dans ce projet, nous avons montré que EhPAK est un élément régulateur clé de la polarité, de la mobilité et de la phagocytose.

La mobilité de E. histolytica est stimulée lors de l'invasion de tissus. Nos résultats préliminaires indiquent que des cytokines humaines ont un effet chimioattractant sur E. histolytica ce qui suggère que ces molécules sont des régulateurs potentiels de la polarisation et/ou de la vitesse de mouvement. Des protéines à la surface de E. histolytica sont en cours d'identification par leur propriétés de liaison aux cytokines.

2. Rôle de la motilité et de l'adhérence dans la mise en place de l'amibiase.P. Tavares, N. Guillén en collaboration avec M.-C. Rigothier (Faculté de Pharmacie), E. Coudrier et F. Amblard (Institut Curie) et avec H. Khun, A. Cardona et M. Huerre (Unité Expertise Histotechnologie et Pathologie, IP), P. Roux (Centre d'Imagérie Dynamique, IP). Projet soutenu par le MENRT à travers l'action "Programme de Recherche Fondamentale en Microbiologie et Maladies Infectieuses et Parasitaires "

Nous avons observé que la lectine Gal-GalNAc, un antigène immuno-dominant qui participe à l'adhérence des amibes aux cellules épithéliales, subit le capping et est enrichi dans des microdomaines lipidiques. L'analyse cellulaire, génétique et moléculaire des fonctions de la myosine II a montré qu'elle est essentielle pour la polarité, la motilité, le capping de récepteurs en particulier celui de la lectine Gal-GalNAc. La myosine II est enrichie dans le cytosquelette suite à l'interaction du parasite avec les entérocytes. Dans un modèle expérimental de l'amibiase, nous avons montré que la période allant de 6 à 12 heures d'infestation est déterminante pour que le parasite acquière les marqueurs nécessaires à sa survie et à son développement au du tissu. Dès son arrivé dans le foie, E. histolytica induit l'apoptose de cellules endothéliales et la nécrose rapide des hépatocytes et de cellules de la réponse immune. L'adhérence et la motilité de E. histolytica sauvage et celle de souches déficientes en myosine II ou en lectine Gal-GalNAc, ont été analysées par microscopie confocale et biphotonique en temps réel. Différents environnements ont été utilisés : le verre, l'apex des entérocytes et le foie entier. La conclusion majeure de ce travail est que l'adhérence contrôle la vitesse de déplacement et la progression des parasites, sous-tendant ainsi le processus pathogène. La souche déficiente en Gal-GalNAc a un taux d'adhérence réduit à 40 % du sauvage, se déplace rapidement " roule " sur l'apex des entérocytes et " glisse " au sein de tissus. En revanche, les phénotypes de la souche altérée dans les fonctions de la myosine II montrent qu'elle ne se déplace pas, présente un mouvement " pendulaire " avec peu de points d'attache sur l'apex des cellules et dans les tissus. Ces caractéristiques se manifestent par des phénotypes très différents lors de l'invasion de tissus. La souche diminuée en lectine Gal-GalNAc envahie très rapidement le tissu et conduit à une " métastase " hépatique, tandis que celle diminuée dans la myosine II est inhibée dans le processus pathogène. Les facteurs de régulation de ces phénotypes sont à l'étude.

3. Analyse cellulaire et biochimique de l'adhérence de E. histolytica aux entérocytes . M. Seigneur en collaboration avec E. Coudrier (Institut Curie). Projet soutenu par le MENRT à travers l'action "Programme de Recherche Fondamentale en Microbiologie et Maladies Infectieuses et Parasitaires "

Lors de l'interaction amibe-entérocyte, la mise en place de mécanismes d'adhérence s'accompagne de changements drastiques au niveau du cytosquelette des cellules cibles. Les microfilaments sont délocalisés et des remaniements membranaires des entérocytes sont produits. Les amibes pénètrent par la suite dans la monocouche de cellules. L'analyse approfondie de l'interaction amibe-entérocytes révèle qu'en dehors de la lectine Gal-GalNAc d'autres protéines se lient à l'apex des entérocytes. Par chromatographie d'affinité avec la bordure en brosse des entérocytes, nous avons mis en évidence plusieurs protéines amibiennes. Une d'entre elles de 20 kDa est sécrétée par les parasites. Le gène codant cette protéine a été cloné, la protéine produite chez E. coli et des anticorps spécifiques fabriqués. Avec la protéine purifiée, nous avons montré que p20 possède une remarquable capacité pour adhérer aux cellules humaines et en particulier à des entérocytes humains différentiés.

4. Dynamique du cytosquelette pendant la phagocytose chez E. histolyticaS. Marion en collaboration avec C. Laurent-Winter, (PT-Protéomique, IP), C. Whilem et F. Gazeau (Université Paris VII). Projet PHAGOAMEBA, Union Européenne - INCO-DEV.

La phagocytose de cellules humaines est un phénomène majeur pendant l'amibiase. Elle est amorcée grâce aux récepteurs de surface amibiens qui reconnaissent des ligands localisés sur les cellules cibles, le signal déclenché active des remaniements du cytosquelette. Plusieurs protéines du cytosquelette participant à la formation des pseudopodes pendant la phagocytose ont déjà été identifiées dans notre laboratoire. En plus de l'actine, nous avons décrit ABP-120, la myosine IB et le complexe Arp2/3. Une souche qui surexprime le gène codant la myosine IB a été fabriquée et nous avons montré, par mesure de la viscoélasticité du cytoplasme, que son cytosquelette est plus dense, un fait qui corrèle avec la réduction du taux de phagocytose. A l'aide de souches déletées pour les différents domaines de la myosine IB nous avons montré que la présence simultanée de deux sites liant l'actine est nécessaire au phénotype. L'analyse en électrophorèse bidimensionnelle de protéines isolées de phagosomes issus des souches sauvages ou MyoIB+ montre des différences qualitatives quant à la nature de complexes protéiques associés au phénotype MyoIB+.

4. Analyse génétique du processus pathogène de E. histolytica par l'approche RNA i.L. Vayssié-Niger et collaboration avec M. Vargas (CINVESTAV, Mexique). Projet PHAGOAMEBA, Union Européenne - INCO-DEV.

Afin d'étudier le processus pathogène de E. histolytica nous avons mis au point la technique d'extinction de fonctions de gènes par interférence des ARN spécifiques (RNAi). Le gène codant la g-tubuline a été choisi car cette protéine est responsable de fonctions essentielles dans toute cellule eucaryote. Les ARN double brin ont été produits par de bactéries qui sont phagocytées par l'amibe. Alternativement, des petits ARN spécifiques et complémentaires de la séquence en nucléotides ont été synthétisés et éprouvés. Les deux démarches se sont avérées fructueuses et la g-tubuline apparaît comme un régulateur du réseau microtubulaire chez E. histolytica.

5. Analyse de la virulence de E. histolytica à l'aide du transcriptomeC. Weber, C. Ausseil en collaboration avec M.-C. Rigothier (Faculté de Pharmacie, D. Mirelman (Institut Weizmann, Israel) et C. Bouchier, L. Frangeul (Genopole, IP),).

Pour identifier les gènes spécifiquement activés lors de la mise en route de l'invasion des tissus par E. histolytica, l'analyse de transcrits amibiens par une approche " transcriptome " a été démarrée. Une banque différentielle enrichie en transcrits produits lors du processus pathogène ainsi qu'une banque de cDNA ont été construites et séquencées. Nos résultats principaux ont été validés par PCR en temps réel. L'analyse informatique de transcrits spécifiques du processus pathogène a montré que 30 % d'entre eux codent des protéines de fonctions inconnues et sont ainsi des candidats privilégiés pour l'identification de nouveaux facteurs de virulence. A partir de ces transcrits un projet destiné à la fabrication de puces à ADN a initié. Des ARN messagers des amibes sauvages ou déficientes dans les fonctions du cytosquelette ou de la lectine Gal-GalNAc, permettront le criblage de ces puces.

Photo: Localisation de PAK et de la F-actine chez Entamoeba histolyticaChez une amibe en mouvement, allant sur cette micrographie de la gauche vers la droite, un pseudopode prédominant (visible au DIC, Differential Interference Contrast) se forme au front de migration et dirige sa locomotion. La micrographie obtenue après marquage en immunofluorescence et analyse en microscopie confocale montre que l'actine filamenteuse (vert) est présente dans le cytoplasme et dans le pseudopode et est enrichie au pôle postérieur de l'amibe. PAK (rouge) est dispersé dans le cytoplasme et est concentré au niveau du pseudopode. La superposition des deux marquages indique que la F-actine et PAK se concentrent dans deux sites opposés contribuant ainsi à la polarisation de E. histolytica lors de la migration. Echelle, 5 µm

Mots-clés: amibiase, cytosquelette, adhérence, Entamoeba, imagerie



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Lambrecht, Marie-Régine,lambrech@pasteur.fr Guillén-Aghion, Nancy. Directeur de Recherche CNRS.nguillen@pasteur.fr

Labruyère-Dadaglio, Elisabeth. Chargée de Recherche, I.P.

Seigneur, Marie. Chargée de Recherche, INRA.

Vayssié-Niger, Laurence. Post-Doctorant EU.

Marion, Sabrina. Etudiante en thèse de Doctorat.

Blazquez, Samantha. Etudiante en thèse de Doctorat.

Ausseur, Christophe. Etudiant D.E.A.
Weber, Christian. Ingenieur, I.P.

Lambrecht, Marie-Régine, Secrétaire, I.P.

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