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Version PDF      Repliement et Modélisation des Protéines - CNRS URA 2185


  Responsable : Michel Goldberg (goldberg@pasteur.fr)


  resume

 

L'Unité combine la physico-chimie, la biochimie, la génétique, et la modélisation des protéines pour étudier divers problèmes liés à leur structure, leur fonction et leur intégration dans divers processus cellulaires tels que: l'acquisition de leur conformation fonctionnelle in vitro et in vivo, les mécanismes de transmission moléculaire de la conformation anormale d'agents pathogènes non conventionnels (protéines "prion"), et les aspects énergétiques des interactions entre protéines et ligands spécifiques.



  rapport

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La thématique principale de l'Unité concerne l'acquisition de la structure tridimensionnelle particulière (ou "repliement") qui confère à chaque protéine sa fonction biologique spécifique. Ces travaux sont menés à quatre niveaux:

- l'étude expérimentale in vitro des mécanismes responsables du repliement

- l'étude expérimentale du contrôle du repliement des protéines de l'enveloppe bactérienne

- l'étude des mécanismes de transmission de la conformation pathogène du prion responsable des encéphalites spongiformes

- l'étude par modélisation de la stabilité des protéines et de l'énergie de leurs interactions.

I- Repliement des protéines in vitro (Michel Goldberg)

Ces recherches portent sur la connaissance, au niveau fondamental, des mécanismes qui permettent à une protéine d'acquérir en quelques secondes la structure tridimensionnelle complexe, dite "native", qui lui confère ses propriétés biologiques. Les connaissances ainsi acquises sont utilisées pour améliorer la structuration de protéines, en particulier dans des processus industriels liés aux biotechnologies.

a- Etude du rôle des ponts disulfures dans le repliement du lysozyme de poule (Michel Goldberg, Nicole Jarrett, Hideki Tachibana et Alain Chaffotte)

Nous avions précédemment montré l'importance des ponts SS du lysozyme oxydé dans l'acquisition quasi instantanée de sa structure secondaire et dans la stabilisation d'intermédiaires de repliement (cf rapport de l'année 2001). Pour comprendre le couplage entre ponts disulfures et acquisition d'éléments locaux de structure tridimensionnelle native, nous avons cherché à comparer, lors du repliement oxydatif du lysozyme réduit, les cinétiques de formation des ponts disulfures et de motifs antigéniques qui ne peuvent être reconnus par un anticorps monoclonal que si la protéine est (au moins localement) correctement repliée. Deux motifs antigéniques, présents sur deux faces opposées de la molécule repliée et dépendant du repliement de deux régions topologiquement distinctes de la chaîne polypeptidique ont été étudiés. Les cinétiques d'apparition de leur antigénicité vis-à-vis des deux anticorps monoclonaux correspondants ont pu être observées grâce à une technique d'immunomarquage pulsé mise au point au laboratoire. L'analyse quantitative de ces cinétiques et leur comparaison avec les cinétiques d'apparition d'espèces à 1, 2, 3 ou 4 ponts disulfures et de réapparition des structures secondaire et tertiaire natives ont montré que le motif antigénique porté par le domaine hélicoïdal du lysozyme apparait, en même temps que la structure secondaire hélicoïdale, par échange de ponts disulfures au sein d'espèces à 2 SS. La formation du 3ème ponts SS coïncide avec l'apparition du deuxième motif antigénique, porté par le domaine beta du lysozyme. Parmi tous les variants à 2 SS (fournis par Hideki Tachibana - Université de Kobe, Japon) seul celui contenant les ponts internes au domaine hélicoïdal (6-127 et 30-115) est reconnu par l'un des anticorps. L'autre anticorps ne reconnaît aucun des variants à 2 SS. Sachant que le pont 76-94 est le dernier à se former, nous avons ainsi pu définir l'ordre dans lequel apparaissent les ponts disulfures natifs et montrer leurs roles respectifs dans la formation des divers niveaux de structure de la molécule. Ces résultats donnent une image détaillée du repliement oxidatif du lysozyme, et jettent un pont entre le repliement "naturel" du lysozyme dans la cellule et les études réalisées in vitro sur le lysozyme oxydé. Ils mettent particulièrement en valeur le rôle précoce des ponts disulfures dans l'orientation du repliement de la protéine vers son état natif.

b- Production et étude d'une protéine recombinante, candidat vaccin contre le paludisme (Alain Chaffotte et Anne-Gaëlle Planson)

Le fragment C-terminal F19 de la protéine MSP1 (Merozoite Surface Protein) de Plasmodium falciparum est un candidat vaccin contre le paludisme. Lorsqu'il est produit sous forme fusionnée à MalE (protéine affine du maltose) dans l'espace périplasmique, il subit un processus d'oxydation permettant la mise en place correcte de ses 6 ponts disulfure et acquiert donc une conformation "native", ainsi que l'ont montré nos études antérieures par RMN bidimensionnelle du fragment isolé. Plusieurs résonances ont pu être identifiées par comparaison avec les spectres du fragment homologue produit par recombinaison dans des cellules d'insecte. Ces résonances correspondent à divers sites de la structure tridimensionnelle de la molécule. L'expression périplasmique directe du fragment F19, c'est-à-dire à l'état individuel non fusionné, a été testée. Le fragment est bien retrouvé dans le périplasme, avec une masse molaire conforme, sous forme soluble et totalement oxydée. Son immunoréactivité vis-à-vis de 4 anticorps monoclonaux spécifiques, est largement affectée ce qui indique une altération de sa conformation de surface en comparaison de celle de F19 produit dans des cellules d'insecte. Par ailleurs, les spectres de RMN bidimensionnelle sont caractéristiques d'une protéine très majoritairement non repliée. La mise en évidence de polymères par électrophorèse laisse présager d'une distribution hétérogène et non conforme des ponts disulfure aboutissant à une conformation non native. La comparaison des caractéristiques structurales du fragment F19 produit, soit à l'état individuel, soit par l'intermédiaire d'une fusion à MalE, met en évidence les propriétés remarquables de la protéine MalE en tant qu'assistant au repliement oxydatif de protéines ou de fragments protéiques fusionnés à son extrémité C-terminale ("chaperon interne"). L'approfondissement de ce mécanisme d'assistance est entrepris. Il consiste en une étude détaillée des propriétés comparées du repliement de MalE au sein de la fusion MalE-F19, dans laquelle F19 est maintenu oxydé ou au contraire dénaturé par réduction de ses cystéines.

c- Cinétique d'association-dissociation et de repliement de la DHFR R67 (Christophe Bodenreider et Annick Méjean)

Dans le but d'identifier les évènements moléculaires responsables de l'initiation du repliement d'une protéine "entièrement beta", la dihydrofolate-réductase plasmidique R67 (DHFR R67), nous cherchons à savoir si l'assemblage de deux monomères désordonnés précède le repliement des monomères, ou si au contraire les monomères doivent se replier avant de pouvoir s'assembler en dimères. Pour cela, nous avions l'an passé abordé l'étude de la cinétique de renaturation de la DHFR R67 à pH 5, où elle se renature sous forme de dimères stables. En observant les cinétiques de regain des propriétés spectrales de la protéine (dichroïsme circulaire dans l'ultra-violet lointain, fluorescence de la protéine), nous avions pu identifier trois phases de repliement dont l'une correspond à l'isomérisation cis-trans de résidus de proline. Cette année, en utilisant un signal de transfert entre monomères marqués les uns par un donneur et les autres par un accepteur d'énergie, nous avons identifié la phase correspondant à l'étape d'association et mis en évidence une phase supplémentaire. Nous avons ainsi pu établir, par modélisation, un schéma de repliement qui incorpore l'hétérogénéité conformationnelle des prolines dans l'état dénaturé, une étape de condensation très rapide de la protéine, une étape rapide n'impliquant que peu de structure native, et une étape "moyenne" au cours de laquelle association et structuration du monomère sont fortement couplées. En utilisant un mutant de la DHFR qui reste dimérique à pH 8, nous avons montré que ces phases ne sont pas influencées par le pH. Enfin, nous avons montré que la cinétique de repliement à pH 8 de la DHFR non mutée peut être décrite par le même schéma qu'à pH 5, avec seulement une étape supplémentaire: l'association des dimères en tétramères. Nous avons caractérisé les constantes de vitesse et l'énergie d'activation de chacune des étapes visibles de ce processus, et donc abouti à une description satisfaisante de l'espace énergétique exploré par la protéine au cours de son repliement. En particulier, nous avons montré que l'association en dimères était responsable de la quasi-totalité de l'énergie stabilisant la forme native. Ainsi, nous avons achevé la caractérisation du repliement d'une protéine dont la structure secondaire ne contient que des feuillets beta, ce qui n'avait été fait que très rarement auparavant, et montré qu'il obéit à un mécanisme non hiérachique conditionné par l'association jusqu'au dimère, et entièrement hiérarchique pour la formation du tétramère.

II - Contrôle du repliement des protéines de l'enveloppe bactérienne (Jean-Michel Betton, Nadia Benaroudj, Nathalie Sassoon, Jean-Philippe Arié et Marika Miot)

Afin de comprendre les mécanismes de reconnaissance et de régulation cellulaires liés à la présence de protéines d'enveloppe anormales, nous utilisons l'expression d'un mutant d'une protéine périplasmique modèle, la protéine affine du maltose ou MalE31, dont le repliement défectueux conduit à l'accumulation d'espèces protéiques incorrectement repliées qui s'agrègent et forment des corps d'inclusion dans le périplasme bactérien. Au niveau cellulaire, nous venons de montrer que l'expression de précurseurs possèdant des mutations de séquence signal défectueuses permettait une élimination plus éfficace des conformations incorrectes de MalE31, par rapport à son expression naturelle dans le périplasme. Ces résultats montrent que les facteurs cellulaires, chaperons et protéases, qui interviennent au cours du repliement pour réparer ou éliminer les protéines mal repliées, sont plus actifs sur MalE31 ou plus nombreux dans le cytoplasme que dans le périplasme. Au niveau moléculaire, nous avons résolu, en collaboration avec l'Unité d'Immunologie Structurale, la structure cristalline de MalE31. Les résultats obtenus démontrent clairement que le défaut de repliement de ce mutant s'exerce au niveau d'intermédiaires du repliement cellulaire. Cependant, grâce à l'activité chaperon de la peptidyl-prolyl isomérase périplasmique FkpA qui permet l'obtention d'une forme soluble de MalE31 possèdant une affinité pour le maltose comparable à celle de la protéine sauvage, nous avons pu caractériser les propriétés de transport du maltose de MalE31. En effet, dans ces conditions expérimentales, MalE31 est incapable de former un complexe productif avec le transporteur membranaire du maltose. L'examen de sa structure qui ne renseigne pas sur le mécanisme de repliement défectueux de MalE31 a néanmoins permis d'identifier un nouveau site d'interaction avec les protéines MalF et MalG. Enfin, l'effet de la température sur la croissance des bactéries surexprimant malE31 est activement étudié car nous avons observé que si aucun phénomène d'interférence ou d'inhibition de l'exportation, lié à la surproduction de ce variant, n'était détecté à 30°C, un phénotype thermo-sensible (et léthal) pouvait s'observer à 37°C, mais pas à 42°C. A partir de ces observations, nous avons initié la recherche de suppresseurs du phénotype toxique lié à l'agrégation massive de MalE31 dans le périplasme à 37°C. Une banque de gènes d'E. coli a été construite en clonant des fragments d'ADN dans un vecteur d'expression multicopie. Puis, nous sélectionnerons ou criblerons les clones capables de restaurer la croissance de la souche surproduisant MalE31.

Dans le cadre du programme de Génomique Structurale de l'Institut Pasteur, nous avons entrepris le clonage à haut débit de 350 cibles de Mycobacterium tuberculosis. Les 150 premiers gènes ont été cloné avec succès dans un vecteur d'expression bactérien à l'aide d'une technique de clonage basée sur la recombinaison spécifique de site du phage lambda (Gateway). Dans le cadre de ce programme, nous sommes également intéressés par des systèmes alternatifs de production de protéines recombinantes. Le système de production in vitro, basé sur le couplage transcription-traduction à haut rendement (commercialisé par la société Roche sur le nom de Rapid Translation System ou RTS), a retenu notre attention. En collaboration avec le laboratoire de Chimie des Macromolécules, nous avons testé la possibilité de marquer sélectivement les protéines, produites dans le système RTS, par certains acides aminés enrichis en carbone 13 et azote 15. Ce type de marquage spécifique d'un type d'acide aminé, qui est essentiel pour la préparation d'échantillons pour la spectroscopie RMN, est pratiquement impossible à réaliser dans la bactérie à cause du métabolisme des acides aminés. Nos résultats, obtenus à partir de notre protéine modèle, MalE, et de deux acides aminés, Asp et Arg, représentatifs du métabolisme bactérien, a montré que tous ces résidus ont été quantitativement marqués sans redistribution des atomes lourds au niveau des autres résidus de la protéine.

Toujours dans le cadre du programme de génomique structurale de l'Institut Pasteur, nous avons défini un nouveau projet qui vise à caractériser les protéases auto-compartimentées et les chaperons de M. tuberculosis. Le séquençage du génome de M. tuberculosis a montré qu'il possède un complexe protéolytique homologue au protéasome des eucaryotes normalement absent chez l'ensemble des autres eubactéries. M. tuberculosis contient aussi deux gènes codant pour la protéase ClpP alors qu'E. coli n'en contient qu'un seul. Nous espérons mettre en évidence des spécificités dans les mécanismes d'action de ces protéases qui pourraient être reliées à une fonction dans la survie et virulence de M. tuberculosis. A plus long terme, nous étudierons aussi les protéines de stress, dont les chaperons moléculaires. En effet, M. tuberculosis possède des chaperons de la famille de DnaK et GroEL (déjà bien caractérisées chez E. coli), mais aussi de nouvelles protéines de stress dont la fonction est totalement inconnue.

III- Structure et mécanisme d'infectiosité du prion (Patrick Bittoun, Pierre Falanga, Michel Goldberg, Mireille Hontebeyrie)

Il est désormais communément admis que l'agent pathogène responsable des encéphalites spongiformes (Creuzfeldt-Jakob chez l'homme, Vache folle, tremblante du mouton) ne contient aucun acide nucléique et est constitué uniquement d'une forme anormalement repliée (PrPSc), le "prion", d'une protéine présente chez l'individu sain sous une forme normalement repliée (PrPc), non pathogène. Bien que la conformation de la protéine PrPc normale ait été déterminée, ni celle de la PrPSc infectieuse, ni le mécanisme de conversion de la PrPc en PrPSc ne sont actuellement connus. Nous avons, au début de cette année, lancé un projet visant d'une part à élucider la structure de la PrPSc sur la base d'une modélisation guidée par des contraintes expérimentales, et d'autre part à identifier la nature des interactions intermoléculaires impliquées dans la conversion de la PrPc en PrPSc. Cette année a été consacrée en grande partie à l'obtention, l'équipement et la mise en service d'un laboratoire sécurisé de type P3, et à l'implantation des nouvelles techniques expérimentales requises par ce projet.

Cependant, nous avons aussi entrepris de mieux caractériser et, éventuellement d'améliorer, notre source de PrPSc. Le matériel d'étude que nous utiliserons sera la PrPSc produite par une lignée de cellules en culture que nous a fournie Hubert Laude (INRA- Jouy en Josas). Ces cellules sont, en l'absence d'infection, hétérogènes du point de vue de leur production en PrPc. Nous avons montré que cette hétérogénéité ne semble corrélée ni aux phases du cycle cellulaire, ni à la taille des cellules. Dans l'espoir d'obtenir une meilleure source de PrP, nous avons isolé plusieurs clones cellulaires homogènes exprimant à leur surface de très forts niveaux de PrPc. Nous avons également isolé, comme contrôle, des clones à faible niveau d'expression membranaire. Nous avons étudié leurs niveaux d'expression de PrP totale (intracellulaire et membranaire), et observé que deux clones à forte expression membranaire produisaient, après infection par le prion, beaucoup moins de PrPSc que la population de départ. Si cette observation devait se vérifier pour d'autres clones, il semblerait que les cellules à fort niveau de PrPc membranaire auraient subi une (des) mutation(s) interférant avec la conversion PrPc --> PrPSc. On pourrait alors supposer que, dans la population de départ, ce sont les cellules à faible expression membranaire qui produisent la PrPSc. Cette hypothèse est en cours de vérification. Si elle venait à se confirmer, la comparaison de ces deux types de clones devrait conduire à l'identification d'éventuels facteurs impliqués dans la régulation de la conversion.

Par ailleurs, nous avons lancé un programme de production d'anticorps monoclonaux dirigés contre la surface de la partie de la PrPSc résistante aux protéases dans le but d'identifier les régions de la chaîne peptidique exposées au solvant dans cette forme de la PrP.

IV- Modélisation moléculaire des énergies et processus d'assemblage des protéines (Arnaud Blondel, Roland Nageotte et Josselin Noirel)

Nous poursuivons le développement des théories physiques décrivant les macromolécules biologiques avec les motivations suivantes:

- proposer des méthodes de modélisation des énergies d'association entre protéines qui soient suffisamment rapides et fiables pour représenter une alternative recevable à l'approche expérimentale. Les enjeux sont importants pour l'analyse des associations impliquées dans divers processus biologiques et/ou pour la conception de nouveaux agents thérapeutiques.

- être capables d'identifier les conformations pertinentes des systèmes macromoléculaires. Les applications peuvent être soit la recherche du mode d'association de molécules, protéines ou agents thérapeutiques, ou encore l'élucidation de mécanismes complexes comme le repliement des protéines.

Pour développer les méthodes de modélisation quantitative de l'énergie libre d'associations entre protéines nous avons, au cours des dernières années, mené simultanément l'étude expérimentale et théorique d'un système modèle, la dihydrofolate réductase DHFR R67. Cette protéine de résistance à un antibiotique est formée par l'association de 4 sous-unités identiques. Nous avons construit par génie génétique des variants permettant de sonder l'importance des différents contacts entre sous-unités. Le mécanisme des associations a été étudié grâce à des mesures en cinétique et à l'équilibre, et l'énergie de ces associations a été déterminée par des méthodes très précises mises au point au laboratoire (cf rapport 2001).

Parallèlement, afin de tester les méthodes théoriques, les énergies mises en jeu dans ces associations ont été calculées par modélisation à l'aide d'une méthode de calcul des variations d'énergie libre, conçue et développée au laboratoire, qui réduit très significativement les incertitudes. Cette méthode, qui tient en particulier compte des interactions électrostatiques à longue distance, a été implémentée au laboratoire dans la version académique du programme, CHARMM, exécutable sur stations de travail Unix/Linux et des super-calculateurs massivement parallèles. En tenant compte de la contribution énergétique des relaxations structurales consécutives aux mutations, nous avons obtenu de bonnes propriétés de convergence (~0.4 kcal/mol par calcul) et un bon accord avec les données expérimentales (~0.4 kcal/mol de différence moyenne).

Les années précédentes avaient apporté beaucoup de ces résultats. Un certains nombre de points ont été approfondis en 2002;

- Le modèle mathématique utilisé dans l'analyse des résultats expérimentaux pour déterminer l'affinité des complexes a été complété pour prendre en compte les différentes réactions possibles. L'importance relative de ces réactions a été déterminée expérimentalement. La robustesse du modèle a été testée sur les données expérimentales.

- Les fondements théoriques de la méthode de calcul d'énergie libre ont été approfondis. Les méthodes utilisés dans la littérature ont été évaluées, notre méthode a été validée et de nouvelles perspectives ont été ouvertes.

Ainsi, l'ensemble de ces travaux a fourni les résultats suivants:

- Un jeu de données expérimentales précises permettant de tester les prédictions sur les interactions protéine-protéine a été obtenu.

- Il semble ainsi possible de prédire par modélisation, avec une précision comparable aux expériences, l'effet de mutations sur l'assemblage de protéines.

- Dans la mesure des calculs effectués, les champs de forces et méthodes de modélisation utilisés dans le programme CHARMM permettent de bien rendre compte de la physique des macromolécules biologiques, et semblent donc applicables à d'autres problèmes de modélisation. Il nous parait important de préciser qu'une série de calculs prenait environ 6 mois lorsque ce projet a été conçu et démarré, qu'en 2000 il prenait de l'ordre de 2 mois sur les station de travail les plus puissantes, mais que sur les PC puissants de ce jour il faut conter 3 semaines, et sur les clusters de PC et super-calculateurs ( > 1 Tflops), ces mêmes calculs ne devraient prendre que 2-3 jours. Cela représente bien moins que le temps requis pour obtenir le résultat par une approche expérimentale...

En partant du constat que les méthodes mises au point semblaient bien appréhender les interactions entre macromolécules biologiques de structures connues, nous nous sommes intéressés à l'identification des conformations pertinentes lorsque celles-ci sont inconnues. Le champ d'application couvre la prédiction d'association entre molécules, protéines ou agents thérapeutiques, ou l'élucidation de mécanismes biologiques complexes. La difficulté provient de la complexité structurale des systèmes biologiques, composés de millier d'atomes agencés précisément. Nous avions développé précédemment un algorithme d'exploration des conformations possibles. Cet algorithme a été repris et nous avons développé des outils pour en évaluer la performance. Il utilise la dynamique moléculaire accélérée pour générer des structures qui sont "triées" par combinaison/groupage. Nous avons ainsi pu proposer la structure d'un complexe afin de mieux comprendre l'interaction et l'effet des mutations, ce qui montrait la puissance de la méthode.

V- Apport des méthodes physicochimiques de l'Unité à diverses collaborations (Alain Chaffotte - Michel Goldberg - Roland Nageotte)

Comme c'est le cas depuis de nombreuses années, l'Unité met au service de la collectivité scientifique, en particulier pasteurienne, son équipement et ses compétences dans l'étude physico-chimique des protéines en solution et de leurs interactions. Elle participe à la conception d'expériences d'ultracentrifugation analytique, d'élutriation, de spectroscopie de fluorescence, de spectroscopie infrarouge par transformée de Fourier, de dichroïsme circulaire, et de cinétiques rapides, réalise les expériences correspondantes et les interprète au bénéfice des équipes qui les sollicitent. Depuis le milieu de cette année, certaines de ces activités ont été placées dans le cadre de la "Plate forme technologique de Biophysique des macromolécules et de leurs interactions" (Patrick England) de l'Institut Pasteur

VI- Enseignement

L'Unité a la charge de l'organisation du Cours de Biochimie des Protéines (co-Directeurs A. Chaffotte et J-M. Betton) de l'Institut Pasteur associé au DEA de "Structure, Fonction et Ingénierie des Protéines (Paris 6/ Paris 7/ Paris11/ ENS/ Polytechnique/ CEA), et des membres de l'Unité ont participé aux travaux pratiques de ce cours en 2002.

Deux étudiant de DEA et trois thésards étaient en formation dans l'Unité au cours de l'année académique 2001-2002.

Mots-clés: prion, périplasme, modélisation, physico-chimie, protéomique



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  LENOIR Lucile (llenoir@pasteur.fr) BENAROUDJ Nadia, IP, Chargée de Recherche (nbena@pasteur.fr)

BETTON Jean-Michel, CNRS, Directeur de Recherche 2 (jmbetton@pasteur.fr)

BLONDEL Arnaud, IP, Assistant (ablondel@pasteur.fr)

CHAFFOTTE Alain-François, IP, Chef de Laboratoire (chaffott@pasteur.fr)

FALANGA Pierre, IP, Chargé de Recherche (pfalanga@pasteur.fr)

GOLDBERG Michel, IP, Professeur (goldberg@pasteur.fr)

HONTEBEYRIE-JOSKOWICZ Mireille, IP, Chef de Laboratoire (mhj@pasteur.fr)

DE ALMEIDA Paulo Cezar, Univ. Mogi das Cruzes, Brésil, Chercheur post-doctoral

Arié Jean-Philippe, UP11, Doctorant

BITTOUN Patrick, IP, Chercheur post-doctoral (pbittoun@pasteur.fr)

BODENREIDER Christophe, UP7, Doctorant

DE LAS HERAS Sanchez Ana Isabel, Etudiante Erasmus (Espagne)

JARRETT Nicole, Univ. of Arizona, USA, Etudiante

MIOT Marie-Caroline, UP7, DEA

NOIREL Josselin, UP7, DEA

PHICHIT Ping, UP7, DEA

PLANSON Anne-Gaëlle, UP7, Doctorante

TACHIBANA Hideki, Univ. de Kobe, Professeur (Japon)
NAGEOTTE Roland, IP, Ingénieur (nageotte@pasteur.fr)

SASSOON-CLAVIER Nathalie, IP, Technicienne (nsassoon@pasteur.fr)

LENOIR Lucile, IP, Secretaire (llenoir@pasteur.fr)

NAVARRO-MARTINEZ Maria, IP, Responsable de Préparation

NGUYEN Huuu-Huan, IP, Agent de Laboratoire

NINO Marguerite, IP, Agent de Laboratoire

TOMMASINO Patrice, IP, Agent de Laboratoire


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