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Version PDF      Biochimie et biophysique des macromolécules


  Responsable : Deshmukh N. Gopaul (gopauld@pasteur.fr)


  resume

 

Le laboratoire de Biochimie et Biophysique des Macromolécules se consacre a la caractérisation des complexes protéine/ADN et protéine/protéine par la détermination de leurs structures tridimensionnelles aux moyens de la diffraction aux rayons X. Les constantes de fixation ainsi que les paramètres énergétiques sont parallèlement détermines par la fluorescence et la microcalorimétrie.



  rapport

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Le laboratoire de Biochimie et Biophysique des Macromolécules a été crée au début de 2002. La thématique principale est la caractérisation biochimique et structurale des complexes macromoléculaires, notamment dans le cadre des interactions entre les recombinases, de la famille des Tyrosine site-specific recombinases, et leurs substrats ADN. Nous utilisons la cristallographie et la diffraction aux rayons-x pour déterminer les structures des complexes protéine/protéine ou protéine/ADN. Nous avons aussi commencé à travailler en collaboration avec des groupes du campus sur d'autres projets impliquant des interactions protéine/protéine qui interviennent dans la reconnaissance de cellules cibles au cours de la colonisation du Plasmodium falciparum, l'organisme qui est responsable de la Malaria, dans ses hôtes ou vecteurs. Nous avons aussi démarré un projet sur des éléments de complexes participant dans la régulation de la transduction de signaux.

Projet de caractérisation structurale et biochimique des intégrases IntI1 et IntI4.

Le système des intégrons fait intervenir une intégrase IntI et des séquences d'ADN variables attI ou attC. Nous proposons la détermination de la structure tridimensionelle de l'enzyme IntI1 de Pseudomonas aeruginosa et de IntI4 de Vibrio cholerae en présence ou absence de leurs substrats ADN par cristallographie au rayons-x. Nous caractériserons leurs propriètés biochimiques par des mesures des paramètres cinétiques et thermodynamiques avec des substrats fluorescents, par microcalorimetrie ou par Biacore. Nous utiliserons des intermédiaires de recombinaison du type Jonction Holliday comme substrats, ainsi que des ADN linéaires. Cette double approche donnera des résultats qui serviront à mieux comprendre le mécanisme d'établissement de l'équilibre d'isomérisation des intermédiaires et permettra le dévelopement d'inhibiteurs ou d'activateurs, ou des outils moléculaires basés sur les integrases elles memes.

Dans un premier temps, nous procederons a l'élaboration des conditions d'expressions de ces protéines afin de pouvoir produire des quantités suffisantes, de l'ordre du milligramme, pour les essais de cristallisation. L'obstacle majeure étant la solubilité de ces protéines. Nous avons ainsi programmé la construction de plusieurs versions, notamment avec l'adjonction de domaines de protéines plus solubles.

Nous procéderons ensuite aux essais de cristallisation proprement dits. Nous lancerons en parallèle la cristallisation des deux proteines soit avec ou sans leurs substrats ADN. D'autres part nous produirons, par synthèse d'oligonucleotides standard, des substrats qui nous permettrons de mesurer les constantes d'affinités et de cinétique de catalyse.

Nous produirons de par cette approche des substrats marqués a la fluoresceine et mesurerons des changements d'anisotropie de polarisation. Nous espérons pouvoir construire un modèle qui represente les entités moléculaires qui interviennent au cours des différentes étapes de fixation, de la formation du synapse, de l'isomérisation et de la formation des produits recombinés.

L'ensemble des données receuillies seront utilisées pour la synthèse d'inhibiteurs ou d'activateurs des ce recombinases.

Mots-clés: Site-specific recombinase, integase, crystallographie au rayons-x, structure, biochimie



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Fejt, Francoise, (ffejt@pasteur.fr) Gopaul, Deshmukh, IP (Chef de Groupe,gopauld@pasteur.fr) MacDonald, Douglas, Pasteur Foundation (Post-Doc,dmacdona@pasteur.fr) Miras, Isabelle, IP (ITA,imiras@pasteur.fr)

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