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Version PDF      Bactéries anaérobies et Toxines


  Responsable : M. R. Popoff (mpopoff@pasteur.fr)


  resume

 

Etude de la régulation de la toxinogénèse chez Clostridium botulinum et Clostridium tetani, analyse de la fonction des protéines régulatrices BotR et TetR, analyse des systèmes de régulation à deux composants. Etude des toxines clostridiennes de grande taille (toxines de C. sordellii) qui glucosylent des GTPases Rho et Ras et analyse des voies de signalisation régulant le cytosquelette d'actine et les jonctions intercellulaires. Etude de l'entrée dans les cellules des toxines binaires de Clostridium.



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Travaux de recherche sur le botulisme

Etude de la régulation de la toxinogénèse chez C. botulinum

Les neurotoxines botuliques (150 kDa) sont associées de façon non covalente à d'autres protéines non toxiques (appelés "associated non toxic protein" ANTP) pour former des complexes de grande taille (300 à 900 kDa). Les gènes codant pour la neurotoxine botulique et les ANTPs sont groupés sur un segment d'ADN dénommé locus botulique. Ils sont organisés en deux opérons, l'un contient les gènes de la neurotoxine botulique précédé de celui codant pour la protéine non toxique et non hémaglutinante (NTNH), et le deuxième correspond aux gènes des trois protéines hémaglutinantes (HA). Un cinquième gène code pour une protéine (BotR) qui possède les propriétés d'une protéine se liant à l'ADN, est localisé en partie 5' du locus botulique ches C. botulinum C et D et entre les deux opérons chez C. botulinum A et B. Ce gène est également conservé chez C. tetani (tetR). Nous avons montré dans un travail précédent que BotR/A est un régulateur positif de l'expression des gènes de la neurotoxine botulique et des ANTPs, par construction d'une souche de C. botulinum A qui surexprimait le gène botR/A ou de souches chez lesquelles la production de ce gène était inhibée par un système d'ARN messager antisens. BotR/A de C. botulinum A a été produite en tant que protéine recombinante avec un tag de six histidines chez Escherichia coli, et a été purifiée par chromatographie d'affinité. BotR/A purifié ainsi que des lysats de C. botulinum A surexprimant BotR/A ont été testés en gel retard avec l'ADN des régions promotrices des deux opérons. Des retards de migration électrophorétique des ADN testés ont été observés en présence des lysats de C. botulinum A mais pas avec BotR/A purifiée. Par contre, BotR/A en présence de core enzyme de la RNA polymerase de E. coli induit des retards de migration indiquant que BotR serait un facteur sigma alternatif de la même famille que TxeR de Clostridium difficile. La liaison du complexe BotR/A-core enzyme de la RNA polymerase s'observe principalement avec les ADN des régions promotrices des deux opérons du locus botulique et plus faiblement avec les promoteurs des gènes internes signifiant que les gènes de la neurotoxine botulique A et des ANTPs sont exprimés essentiellement sous forme polycistronique.

Passage de la barrière intestinale par la toxine botulique A

Les cellules intestinales CaCo-2 cultivées sur filtre forment des monocouches de cellules polarisées avec constitution des jonctions intercellulaires. BoNT/A purifiée ou sous forme de complexe, a été inoculée du côté apical des cellules. Le passage de la neurotoxine a été évalué en déterminant la dose létale (DL50) par titrage chez la souris. L'intégrité de la monocouche cellulaire, suivie par mesure de la résistance électrique transépithéliale et visualisation en immunofluoresence de l'actine, des jonctions apicales (ZO1) et basolatérales (E-cadhérine), n'a pas été modifiée au cours du traitement par les toxines. La neurotoxine botulique A seule est capable de traverser une monocouche de cellules CaCo-2 (passage de 1 à 5%), mais son passage est amélioré lorsque la neurotoxine est sous forme de complexe. Ce passage intervient à 37°C et est bloqué à 4°C. De plus, il est saturable dans un délai de 20-30 min. Ceci indique qu'il s'agirait d'un processus d'endocytose-transcytose médié par récepteur. Ce mode de transport de la neurotoxine botulique à travers les monocouches de cellules polarisées est en cours d'étude.

Etude d'un système de vectorisation basée sur la toxine iota de Clostridium perfringens

La toxine Iota produite par C. perfringens type E est une toxine binaire. C'est-à-dire qu'elle consiste en 2 protéines indépendantes non réunies par une liaison covalente ou un pont disulfure, l'une étant le composant binding (Ib) et l'autre le composant enzymatique (Ia). Ib reconnaît un récepteur à la surface cellulaire et permet l'internalisation de Ia dans le cytosol. Ce dernier catalyse la réaction d'ADP-ribosylation ayant pour substrat l'actine cellulaire sous forme globulaire. L'intérêt de cette toxine est d'être utilisable pour internaliser dans les cellules des protéines hétérologues telles que des anticorps anti toxine botulique dans une approche thérapeutique du botulisme.

Le domaine de Ia qui interagit avec le composant Ib a été déterminé à l'aide de fusions entre différents domaines de Ia et l'enzyme C3 de C. botulinum. Cette enzyme, que nous avons caractérisée au laboratoire, est une ADP-ribosyltransférase dont la cible est la protéine Rho et qui ne rentre pas de façon efficace dans les cellules. Un mutant négatif d'activité enzymatique de Ia a été choisi pour générer les fragments de Ia de façon à ce que les protéines fusion ne possèdent que l'activité C3. Les protéines fusion C3-Ia et Ia-C3 ont été testées pour leur activité ADP-ribosylante de C3 in vitro, pour leur activité cytotoxique (arrondissement des cellules, désorganisation du cytosquelette d'actine après visualisation par la phalloidine fluorescente, ADP-ribosylation de la protéine Rho in vivo) en présence de Ib, et pour leur capacité à se fixer sur les cellules Vero préalablement incubées avec Ib par cytométrie de flux. La région minimale qui permet la liaison des protéines fusion au composant Ib fixé à la surface des cellules ainsi que leur cytotoxicité en présence du composant Ib, correspond à 129 acides aminés en position centrale de Ia. Cette région de 129 acides aminés est suffisante pour permettre l'internalisation de protéine fusion en présence de Ib et peut être utilisée comme un système de vectorisation de protéines dans les cellules .

L'entrée de la toxine Iota dans les cellules a été étudiée avec des monocouches cellulaires polarisées (CaCo-2). Lorsque la toxine Iota (composants Ia et Ib) est ajoutée du coté apical ou du coté basolatéral, il s'en suit une baisse rapide de la résistance transépitheliale (TER), avec désorganisation des filaments d'actine et des jonctions intercellulaires observée en immunocytochimie. Lorsque Ib est incubé du coté basolatéral et Ia du coté apical, il s'en suit une baisse de TER et une modification du cytosquelette d'actine comparable aux effets observés avec les deux composants de la toxine Iota appliqués d'un même coté des cellules. Ceci indique que Ib est internalisé indépendamment de Ia dans les cellules et qu'il effectue un recyclage au niveau de la membrane lui permettant de capter de nouvelles molécules de Ia. La réexposition de Ib à l'autre face cellulaire a été montrée par biotinylation et immunoprécipitation.

Etude de toxines de Clostridium qui modifient la barrière intestinale

Certains Clostridium sont responsables de pathologies du tractus digestif en produisant de puissantes toxines, agissant sur les cellules épithéliales intestinales.

La toxine epsilon produite par C. perfringens D est responsable d'entérotoxémie. Nous avons étudié l'interaction de cette toxine avec des cellules rénales de chien qui ont la propriété de cultiver sur filtre en formant une barrière cellulaire comparable à celle de l'épithélium intestinal. La toxine epsilon s'associe à un récepteur spécifique à la surface des cellules, s'oligomérise et forme des pores. L'activité de formation de pore a été aussi étudiée avec des bicouches lipidiques artificielles. La toxine epsilon induit très rapidement une augmentation de la perméabilité des monocouches cellulaires due à son activité de formation des pores.

Les toxines de grande taille de C. difficile (ToxA et ToxB) et de C. sordellii (LT) glucosylent des petites protéines G de la famille Rho et Ras, et ainsi modifient le cytosquelette d'actine et induisent une ouverture des jonctions intercellulaires. La toxine LT qui inactive uniquement Rac parmi les protéines Rho, occasionne une désorganisation des jonctions intercellulaires médiées par la E-cadherine, alors qu'elle a peu d'effet sur les jonctions intercellulaires apicales. Elle a également un effet inhibiteur de la neurosécrétion qui ferait intervenir une baisse de production des phosphoinositides ou une baisse de stimulation de la phospholipase D qui sont contrôlés par Rac.

Photo: Changement du cytosquelette d'actine induit par la toxine iota ou les protéines chimériques iota-C3. Les cellules Vero ont été traitées avec 10-7 M de toxine iota sauvage (Ia+Ib), ou Ia-C3, Ia(129-257)-C3 en présence de Ib pendant 2h à 37°C. Les cellules on été fixées et colorées avec la phalloidine fluorescente. Les cellules contrôles montrent de nombreux câbles d'actine, tandis que le cytosquelette d'actine est complètement dépolymérisé par la toxine iota sauvage. Les constructions Ia entier ou contenant le domaine minimal Ia(129-257) fusionné à C3 produisent une disparition des câbles d'actine et un aspect fripé de l'actine corticale qui sont caractéristiques de l'activité de C3.

Mots-clés: Clostridium, toxine, botulisme, actine, protéines G



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