Notre unité étudie les rôles respectifs des facteurs de transcription et des machineries de remodelage de la chromatine lors de l'activation et de la répression des gènes dans les cellules de mammifères. Nous étudions le rôle de plusieurs familles de facteurs de transcription individuels dans le contrôle de la différenciation cellulaire et de l'organogenèse, ainsi que dans la croissance cellulaire ou l'apoptose. Nous procédons à l'inactivation complète ou conditionnelle de gènes chez la souris et utilisons des puces à ADN ainsi qu'une recherche in silico. Nos travaux ont des implications pour la compréhension de la transformation cellulaire viro-inductible ou non et pour la compréhension de certaines maladies comme le diabète de type II, l'insuffisance rénale ou hépatique.

Responsables : Fatima Mechta-Grigoriou et Jonathan Weitzman. Autres membres du groupe : Maya Ameyar-Zazoua, Damien Gérald, Stéphane Girardin, Chaouki Miled, Marta Wisniewska.

Le facteur de transcription ou complexe AP1 regroupe l'ensemble des dimères formés entre les produits des proto-oncogènes jun (c-jun, junB, junD) et fos (c-fos, fosB, fra-1, fra-2). Il constitue un médiateur clé de multiples signaux extracellulaires et intervient dans l'initiation d'une réponse génétique appropriée de la cellule. Notre laboratoire s'intéresse aux fonctions des produits des gènes jun en utilisant des approches génétiques et biochimiques. Nous avons précisé le rôle des structures cytoplasmiques et d'un récepteur intracellulaire du LPS dans l'activation de c-jun par phosphorylation, en réponse à un stress ou une infection bactérienne. Nous avons montré que la concentration relative de différentes protéines Jun contrôle la progression du cycle cellulaire. Les protéines Jun contrôlent aussi la transformation par l'oncogène RAS. Nous avons également montré que JunD joue un rôle protecteur contre l'apoptose ou la sénescence cellulaire dépendante de p53, en réponse à certaines cytokines ou aux signaux de stress. L'étude des souris ayant une simple ou une double mutation cJun et JunD a mis en lumière le rôle pléiotropique de ces gènes au cours du développement. c-jun et junD interviennent dans la morphogénèse cardiaque et l'angiogénèse embryonnaire. Les défauts angiogéniques et cardiaques observés dans les mutants c-jun^-/-junD^-/- sont corrélés à la dérégulation de certains gènes pro-angiogéniques, définis comme cibles de c-Jun et junD. Afin de mieux comprendre ces observations " in vivo ", nous développons une approche d'étude génomique systématique basée sur les microarrays. Cette technique nous permettra aussi d'identifier de nouveaux gènes cibles de AP-1 impliqués dans la réponse à divers stress cellulaires.

Responsable : Marco Pontoglio Autres membres du groupe : Claire Chéret, Antonia Doyen, Lionel Gresh, Andreas Reimann

Hepatocyte Nuclear Factor 1alpha et beta (HNF1alpha et HNF1beta) sont deux homéoprotéines qui sont apparues au cours de l'évolution avec les premiers Vertébrés. Elles partagent de fortes homologies et sont exprimées dans les épithélia polarisés de différents organes tels que le foie, le rein, le pancréas et l'intestin où elles contrôlent l'expression de gènes cibles spécifiques de ces tissus. Des souris déficientes en HNF1beta meurent à 7.5 jours de développement embryonnaire d'un défaut de la différenciation de l'endoderme viscéral extra-embryonnaire. D'autre part, l'inactivation conditionnelle de ce gène dans le foie entraîne un défaut de différenciation des canaux biliaires causant une choléstase. L'inactivation d'HNF1alpha entraîne des dysfonctionnements post-nataux du foie, du rein et du pancréas. Les souris déficientes en HNF1alpha souffrent d'une hypercholestérolémie, d'une hyperphénylalaninémie, d'un syndrome rénal de Fanconi et d'un grave défaut de sécrétion d'insuline. Par ailleurs, des mutations dans les gènes HNF1alpha et beta sont associées, chez l'homme, avec un diabète de type II (MODY3 et MODY5). Nous avons aussi montré que l'expression hépatique de certains gènes codants pour des facteurs du complément (particulièrement C5 et C8 )est déféctive ce qui comporte un défaut de l'assemblage du complexe d'attaque de la membrane qui est normalement induit par l'activation du complément. Si l'inactivation de HNF1alpha seul ne comporte pas de défauts du dévéloppement, des souris qui sont homozygotes HNF1alpha-/- et en même temps hétérozygotes pour HNF1beta meurent pendant le développement. Les mécanismes responsables de ce phénotype sont actuellement à l'étude. Notre but est de comprendre la façon dont HNF1alpha et HNF1beta contrôlent l'expression de leurs gènes cibles et, par conséquent, leur rôle dans la différenciation cellulaire. Pour cela, nous utilisons des microarrays et une approche in silico afin d'identifier le transcriptome HNF1.

Responsable: Christian Muchardt .Autres membres du groupe : Brigitte Bourachot, Marie Guillemé, Peggy Rematier

Dans la cellule eucaryote, l'ADN s'associe aux histones pour former la chromatine. Dans ce contexte, l'ADN devient partiellement inaccessible. Afin de surmonter cet obstacle, la cellule s'est dotée de larges machineries multi-protéiques qui utilisent l'énergie libérée par l'hydrolyse de l'ATP pour dégager localement l'ADN de l'emprise des histones. L'une de ces machineries est connue sous le nom de complexe SWI/SNF. Ce complexe ouvre la chromatine de manière à faciliter le recrutement de protéines régulatrices sur les promoteurs de certains gènes. Nous avons montré que ce complexe est essentiel pour le développement très précoce de la souris. Plusieurs observations suggèrent également que le complexe joue un rôle dans la régulation de la croissance cellulaire. Notamment, nous avons montré que la surexpression de Brm, la sous-unité catalytique du complexe, ralentie la croissance de cellules cancéreuses. Inversement, l'inactivation du gène codant pour Brm chez la souris provoque une augmentation de la prolifération cellulaire. Une autre sous-unité du complexe, la protéine SNF5/INI1 est codée par un gène " suppresseur de tumeurs " impliqué dans une forme très agressive de cancer chez le jeune enfant. Nous avons montré que l'inactivation d'une copie de ce gène, chez la souris, provoque également des tumeurs qui présentent de nombreuses similitudes avec les tumeurs humaines. Actuellement, nous étudions le rôle du complexe SWI/SNF en phase de quiescence (G0) et de rentrée dans le cycle cellulaire (transition G0/G1).

Responsable : Françoise Thierry. Autres membres du groupe : Sophie Bellanger, Stéphanie Blachon, Caroline Demeret, Sébastien Teissier

Notre recherche vise à élucider les mécanismes de la conversion maligne de cellules du col utérin infectées par le papillomavirus humain HPV18. Le cancer du col de l'utérus est la deuxième cause de mortalité par cancer chez la femme dans le monde après celui du sein. Ce virus infecte exclusivement la muqueuse génitale en se répliquant dans les couches supérieures de l'épithélium. Il code deux oncogènes viraux E6 et E7 qui altèrent la prolifération normale de la cellule en interférant avec les anti-oncogènes cellulaires p53 et pRB. La conversion maligne des lésions infectées par HPV18 est accompagnée de l'intégration de l'ADN viral dans le génome cellulaire à partir duquel la transcription des oncogènes viraux E6 et E7 est fortement activée par une structure en " enhanceosome " que nous avons caractérisée. Cet enhanceosome est spécifique des cellules de carcinome cervical et comporte exclusivement des protéines cellulaires dont nous cherchons à caractériser les interactions in vivo par des techniques d'immunoprécipitation de la chromatine. Au contraire, la transcription des oncogènes viraux est réprimée par le produit du gène viral E2. Ce gène est d'ailleurs spécifiquement inactivé lors de l'intégration de l'ADN viral dans les cellules de carcinome cervical, chez lesquelles la réintroduction de cette protéine induit un fort effet antiprolifératif, du à un arrêt du cycle et à une mort cellulaire par apoptose. Nous étudions les voies activées lors de cette apoptose et les mécanismes moléculaires qui la sous-tendent.

L'expression de c-jun a été analysée par  hybridation " in situ " sur embryons entiers après 8 jours de développement. c-jun est détécté dans la région posterieure du rhombencéphale (A, B), le mesoderme céphalique (B), la partie dorsale du tube neural et le cœur (D). Caudalement, c-jun est détecté dans les vaisseaux intersomitiques et les somites en formation (D). Pour préciser ce profil d'expression, des coupes transversales ont été réalisées selon l'axe antéro-posterieur, comme indiqué en A et D par des doubles flèches. Ainsi, au niveau du rhombencéphale, l'expression de c-jun est restreinte à la partie médiane du tube neural (a). c-jun est également détecté dans les cellules endothéliales du cœur (b), au niveau du septum transversum (c), dans la partie dorsale de la moelle épinière au niveau de la fermeture du tube neural (d), dans la partie ventrale des somites en cours de différenciation, le sclérotome et enfin l'extrémité caudale du tube digestif.

Analyse par Northern blot d'ARN hépatique de souris sauvages, hétérozygotes ou homozygotes pour une mutation nulle de HNF1alpha. Quatre animaux pour chaque génotype sont analysés. Des filtres parallèles ont été hybridés avec des sondes spécifiques dont la nature est précisée à gauche. Pour C6 nous montrons des amplifications par RTPCR avec leur contrôle (beta-actine). Les histogrammes, sur la droite, indiquent les niveaux d'expression moyens (la valeur arbitraire de 100 a été attribuée aux souris sauvages). Les barres représentent la déviation standard de la moyenne. Les étoiles indiquent la signification des différences entre sauvages ou hétérozygotes et homozygotes (*) pour p<0.05 et (**) pour p<0.01 test t de Student.

A) Enregistrement, en temps réel, de l'expression de la protéine E2 de HPV18 fusionnée à la GFP, dans les cellules HeLa. Des images en fluorescence et contraste de phase sont prises différents temps après transfection comme indiqué. La fluorescence s'accumule dans deux cellules sœur à partir d'une même mitose, jusqu'à 23 hr après transfection puis disparaît, indiquant que la protéine est instable. D'autre part, E2 induit une mort par apoptose dans une partie des cellules HeLa transfectées (indiquées par des flèches blanches).

B) Réapparition de la fluorescence dans des cellules HeLa exprimant GFP-E2, 40 hr post transfection, par traitement des cellules avec des inhibiteurs du protéasome : Lactacystine et MG132, indiquant que la protéine est dégradée par la voie ubiquitine-protéasome (Bellanger et al.2001).

OLLIVIER Edith, Institut Pasteur

WEITZMAN Jonathan, Institut Pasteur, Chargé de Recherche (jonnyw@pasteur.fr)

WISNIEWSKA Marta, Postdoc

GARBAY Serge, CNRS, IR (garbay@pasteur.fr)