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  Responsable : HOVANESSIAN Ara (arahovan@pasteur.fr)


  resume

 

Nous étudions les mécanismes impliqués dans la pathogénie du SIDA en relation avec l'infection par le virus d'immunodéficience humaine, VIH. Par ailleurs l'infection virale conduit à la production d'interféron, qui joue le rôle de première barrière contre l'extension de la virémie. Dans cette optique, les principales lignes de recherche sont les suivantes : 1) Etude de l'entrée du VIH et son inhibition par le pseudopeptide HB-19 et la cytokine MK; 2) Rôle du facteur IRF7 dans l'établissement anti-viral; 3) Rôle de la PKR dans l'action de l'IFN; 4) Interaction du virus de l'hépatite C avec son hôte cellulaire



  rapport

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Le pseudopeptide HB-19 inhibe la fixation du VIH à la surface des cellules cibles par le biais d'une interaction avec le domaine C-terminal de la nucléoline (S. Nisole, B. Krust, E. Said)

La fixation du pseudopeptide HB-19 à la nucléoline exprimée à la surface des cellules conduit à un blocage de la fixation et de l'ancrage des particules virales aux cellules cibles, ce qui par voie de conséquence conduit à une inhibition de l'infection. Par ailleurs le couplage de HB-19 à l'aide d'un anticorps spécifique conduit à un rassemblement latéral de la nucléoline, ou capping, et sa colocalisation avec le pseudopeptide. Nous avons identifié le domaine GAR situé à l'extrémité C-terminale de la nucléoline et constitué de la répétition du motif RGG, comme étant seul impliqué dans la fixation du pseudopeptide. Pour finir nous avons démontré qu'un peptide synthétique de 63 acides aminés, et correspondant au domaine GAR, inhibe l'infection par le VIH au niveau de l'attachement du virus aux cellules. Ces données suggèrent que le domaine GAR de la nucléoline joue un rôle fonctionnel dans la phase de fixation et d'ancrage du VIH aux cellules cibles.

Le pseudopeptide HB-19 est préférentiellement retenu au niveau des organes lymphoïdes, où il se fixe à la nucléoline exprimée à la surface des cellules. (B. Krust, A.G. Hovanessian, en collaboration avec L. Edelman)

Nous avons étudié la pharmacodistribution du pseudopeptide HB-19 marqué au tritium (3H), par l'analyse qualitative et quantitative de coupes saggitales de rat entier, à l'aide d'un -radio imager. Après injection intraveineuse HB-19 est distribué rapidement, de façon sélective et stable dans la rate, le foie, les reins et les os. Par contre le pseudopeptide n'est pas détecté au niveau du cerveau ou des muscles. Au niveau des reins l'élimination du peptide a lieu par filtration glomérulaire, et la plupart de la radioactivité excrétée l'est sous forme de métabolites. Par ailleurs, l'injection à des rats de pseudopeptide marqué à la biotine nous a permis d'isoler le complexe HB-19-nucléoline à partir du foie, de la rate, du thymus et de la moelle osseuse. D'après l'ensemble de nos résultats, il est surtout intéressant de noter que le pseudopeptide HB-19 est préférentiellement distribué au niveau des organes lymphoïdes qui constituent le lieu de propagation du VIH.

L'ancrage du VIH aux cellules permissives induit un co-capping des particules virales et de la nucléoline de surface au niveau de radeaux lipidiques.

Le couplage des particules virales à la surface des cellules permissives, à l'aide d'anticorps, conduit à un rassemblement latéral coordonné des virions, ou " capping ", et à leur colocalisation avec des aggrégats formés de la nucléoline, le CD4 et le CXCR4, mais dont est exclu le CD45. Ce phénomène s'accompagne d'une colocalisation des virions et de la nucléoline avec les microdomaines membranaires constitués de gangliosides, et de protéines couplées au glycosylphosphatidylinositol, tel que le CD90 et le CD59. Ceci suggère que l'ancrage du VIH aux cellules induit une réorganisation de protéines membranaires, dont la nucléoline, au niveau de radeaux lipidiques. En accord avec ces données, on observe une copurification de la nucléoline avec les microdomaines membranaires enrichis en glycolipides, qui présentent la particularité d'être insoluble en présence d'un détergent non ionique tel que le Triton-X100. Nos résultats démontrent que l'ancrage des particules virales à la surface des cellules cibles s'accompagne d'un phénomène de capping de la nucléoline, au niveau des microdomaines membranaires de type radeaux lipidiques.

Le facteur de croissance midkine est une cytokine qui inhibe l'infection par le VIH. (Krust B., Nisole S., Said E., Hovanessian A.G.).

La fixation du VIH aux cellules est inhibée par le pseudopeptide HB-19 qui se fixe spécifiquement à la nucléoline exprimée à la surface cellulaire. Les résultats ici présentés démontrent que la Midkine (MK), un facteur de croissance qui présente une affinité pour la nucléoline, est un inhibiteur spécifique de la fixation du VIH aux cellules. L'ARN messager de MK est détectable dans les cellules mononucléées du sang périphérique de donneurs sains, et son expression est fortement augmentée après activation des lymphocytes T. Le mode d'action anti-VIH de MK et l'induction transitoire de son expression dans les lymphocytes en réponse à divers stimuli, tendent à démontrer que MK est une cytokine impliquée dans la pathogénèse associée à l'infection par le VIH. En accord avec ceci, des clones de cellules CEM qui expriment de façon constitutive MK présentent une résistance à l'infection par le VIH, résistance liée à un blocage de la fixation des particules virales. Par ailleurs la coculture de cellules HeLa qui expriment MK avec des cellules HeLa CD4+ confère à ces dernières une résistance au VIH.

 

Rôle du facteur IRF7 dans l'établissement de l'état antiviral en réponse aux infections virales (I. Marié et A. Caillaud)

Nous avons récemment démontré que le facteur de transcription IRF7 (Interferon Regulatory Factor) est responsable de l'induction transcriptionnelle différentielle d'une sous-classe d'interférons de type I en réponse à toute infection virale. IRF7, étant lui-même inductible par l'interféron, est la protéine responsable du feedback positif de l'interféron sur sa propre synthèse. Il assure une réponse antivirale maximale qui permet de stopper le développement du virus dans la cellule infectée et de prévenir l'infection des cellules voisines par action autocrine de l'interféron.

- Etude du mécanisme moléculaire d'activation transcriptionnelle par IRF7

Afin de mieux comprendre les mécanismes de l'activation transcriptionnelle inductible médiée par IRF7, nous nous sommes attachés à déterminer quelles sont les protéines coactivatrices et porteuses d'activité "histone acetyl transférase" qui sont recrutées par ce facteur. Nous avons montré que IRF7 est acétylé in vivo par la famille de coactivateurs pCAF/gcn5 mais pas par la famille p300/CBP. L'acétylation semble être une modification posttraductionnelle essentielle pour la modulation de l'activité du facteur IRF7 in vivo.

- Etude des sites de phosphorylation de IRF7 et recherche de nouveaux gènes cibles

Le rôle essentiel de IRF7 dans l'induction des gènes des interférons en réponse à l'infection virale est maintenant bien établi. Cependant, il semble primordial de déterminer quels sont les autres gènes cibles de IRF7 afin de mettre à jour de nouvelles voies potentiellement antivirales et antitumorales induites en réponse aux infections virales. Afin de réaliser cette étude, nous avons déterminé quels sont les résidus sérines phosphorylés en réponse à l'infection virale. Une lignée cellulaire exprimant de façon inductible un mutant constitutivement actif de IRF7 a été aussi établie. Différentes techniques de criblage différentiel vont être mises en oeuvre afin de déterminer quels sont les gènes induits résultant de l'expression de IRF7: la technique de "representational difference analysis" (RDA) et la technique de "microarrays".

 

Mécanisme d'activation de NF-B par la PKR (Eliane Meurs, Marion Bonnet)

La PKR est une protéine sérine/thréonine kinase cellulaire, dont l'expression est induite par l'interféron et qui est clairement impliquée dans deux voies importantes pour l'action de l'interféron: (1) une voie de signalisation où elle intervient, via l'activation de NF-k B, dans l'induction des gènes (2) une voie de contrôle de la synthèse protéique où elle permet de limiter la traduction des protéines indésirables, par exemple au cours d'une infection virale, via la phosphorylation du facteur d'initiation eIF-2a . Nous avons récemment démontré que le mécanisme d'activation de NF-k B par la PKR ne fait pas intervenir sa fonction kinase mais nécessite uniquement l'interaction de sa partie N terminale, dépourvue d'activité catalytique, avec la sous-unité IKKb du complexe de kinases impliquées dans la phosphorylation de l'inhibiteur IkBa (Bonnet et al, soumis).

Régulation positive de la traduction par TRBP de façon dépendante et indépendante de la PKR (Eliane Meurs, Marion Bonnet; collaboration C.Vaquero; Pitié-Salpetrière et A.Gatignol; Lady Davies Institute; Montreal)

- Détermination des motifs de la TRBP interagissant avec la PKR

La PKR s'active en kinase après liaison sur des structures ARN bicaténaires, gràce à deux motifs DRBD (Double Stranded RNA Binding Domains) situés dans sa moitié NH2-terminale. L'action de la PKR est régulée par différents facteurs, viraux ou cellulaires. Parmi ces derniers, nous étudions le rôle de TRBP, un inhibiteur cellulaire de l'activité kinase de la PKR. Par analyse double-hybride en levure, nous avons montré que TRBP interagit avec la région N terminale de la PKR contenant ses deux DRBD (résidus 1 à 178) et inhibe ainsi l'activation de la PKR ( Daher et al, 2001).

- Rôle stimulateur de TRBP indépendant de son interaction à la PKR

En tant qu'inhîbiteur de PKR , TRBP a pu restaurer la traduction in vitro d'ARNs messagers dans des expériences où nous avons activé la PKR (ARNs messagers contenant une structure ARN bicaténaire additionnelle). Ces expériences ont également fait apparaitre un rôle stimulateur direct de la traduction des ARNs messagers par TRBP, uniquement par son interaction avec l'ARN bicaténaire. Ainsi, nos résultats montrent que TRBP est un facteur cellulaire important pour l'expression de transcrits contenant des régions ARNs bicaténaires à la fois en inhibant la PKR et par un mécanisme indépendant de la PKR. TRBP pourait donc, comme son homologue murin, Prbp, fonctionner comme chaperon dans l'assemblage des particules de nucléoprotéines régulées au niveau traductionnel. [Dorin et al, en revision].

Interactions moléculaires entre le virus de l'Hépatite C et son hôte (Eliane Meurs, collaboration avec Gilles Duverlie ; Université de Picardie; Amiens)

Le meilleur traitement à l'heure actuelle pour l'infection par le VHC, la bithérapie Interféron/Ribavirine, présente une efficacité à long terme limité, dû à des mécanismes de résistances à l'IFN et d'évasion à la réponse immune de l'hôte. La résistance à l'IFN pourrait être due en partie à des variations de séquence dans la protéine virale NS5A. NS5A interagit avec de nombreuses protéines cellulaires dont la PKR mais le rôle de l'interaction NS5A/PKR dans la résistance du virus à IFN est controversé. Nous avions précédemment montré que la résistance du VHC à l'interféron n'impliquait pas l'interaction NS5A/PKR. Ceci a été récemment confirmé par une analyse différentielle de la séquence complète de NS5A provenant de 27 isolats de VHC de génotype 3a de patients sensibles ou résistants à l'IFN. 5 régions ont été identifiées, deux dans la région qui se lierait à PKR et les autres dans la région V3. Certains changements de séquence seraient en rapport avec la résistance à l'IFN mais indépendamment de la PKR (Castelain et al, in press).



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JEWIARZ Danièle, IP djewiarz@pasteur.fr

HOVANESSIAN Ara, CNRS/IP arahovan@pasteur.fr

KRUST Bernard, INSERM bkrust@pasteur.fr

MARIE Isabelle, IP imarie@pasteur.fr

MEURS Eliane, IP emeurs@pasteur.fr

BONNET Marion, Thésard

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