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  Responsable : Pierre TIOLLAIS (tiollais@pasteur.fr)


  resume

 

Les recherches de notre Unité portent sur l'oncogénèse, la virologie moléculaire et le vaccin recombinant contre l'hépatite B. Nous cherchons à identifier des gènes suppresseurs de tumeur impliqués dans le cancer du foie, et à déterminer le rôle de la protéine virale HBX et de l'activation oncogénique de la ß-caténine dans l'oncogénèse hépatique. Notre laboratoire étudie également les relations existant entre la compartimentalisation fonctionnelle du noyau et les leucémies aiguës à promyélocytes. Nous étudions d'autre part la relation entre les virus des hépatites B et C et leur hôte dans le but d'élaborer des anti-viraux. Enfin, nous avons mis au point un protocole de vaccination génétique thérapeutique contre l'hépatite B.



  rapport

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Virus de l'hépatite B et hépatocarcinome

Responsable: Marie Annick BUENDIA

Les mécanismes conduisant au développement d'un cancer du foie chez les patients infectés par le virus de l'hépatite B restent mal connus. La protéine régulatrice virale HBX a été impliquée comme co-facteur dans le processus tumoral, par sa capacité à réguler l'expression de nombreux gènes cellulaires. Nous étudions les interactions d'HBX avec les co-activateurs CBP, p300 et pCAF dans l'activation de promoteurs cellulaires et viraux, et l'activité de protéines HBX sauvages et mutées dans la dérégulation du cycle cellulaire et l'induction d'apoptose. Nous avons récemment initié une recherche à large échelle des gènes cellulaires cibles de la transactivation par HBX. Afin de nous rapprocher de la situation in vivo chez les patients infectés, ces études sont réalisées essentiellement dans des hépatocytes humains primaires ou dans le foie de souris.

 

Mécanismes Moléculaires de l'Oncogenèse Hépatique

Responsable: Marie Annick BUENDIA

Nous étudions les étapes moléculaires de la carcinogenèse hépatique chez l'homme et dans des modèles transgéniques murins. Nous avons montré que la voie de signalisation Wnt est fréquemment activée dans l'hépatocarcinome et dans l'hépatoblastome par des mutations stabilisatrices de la ß-caténine. Nos travaux dans un modèle de souris transgéniques suggèrent que l'activation de la ß-caténine et l'inactivation du gène suppresseur de tumeur p53 représentent des voies alternatives dans la transformation des cellules hépatiques. Notre projet vise à caractériser le réseau de facteurs cellulaires impliqués dans l'oncogenèse induite par l'activation de la voie Wnt. Dans un crible en double-hybride, nous avons récemment identifié de nouveaux partenaires de la ß-caténine et nous recherchons les propriétés fonctionnelles de ces interactions au niveau des jonctions d'adhérence et de la transduction du signal Wnt. Par ailleurs, l'impact de la ß-caténine sur le profil d'expression génique et la progression du cycle est analysé dans des hépatocytes et des fibroblastes primaires humains. Plusieurs gènes cibles de la ß-caténine dans le contexte hépatique sont en cours d'étude.

L'allélotypage des tumeurs à l'aide de marqueurs microsatellites permet de définir des régions chromosomiques fréquemment altérées pouvant contenir des gènes suppresseurs de tumeur. Nous avons cartographié les pertes d'allèle les plus fréquentes dans des échantillons d'hépatocarcinomes humains et murins. Tandis que les tumeurs humaines montrent une grande instabilité chromosomique, l'allélotypage des hépatocarcinomes murins induits par c-Myc a révélé peu de chromosomes altérés. Nos données suggèrent que l'altération de la voie INK4/RB est une étape importante de l'oncogenèse hépatique. De plus, nous avons récemment évalué l'implication de la E-cadherine dans l'hépatocarcinogenèse par une étude fine du chromosome16 combinée à une étude génétique et biochimique de la protéine.

 

Génétique du cancer du foie

Responsable : Anne DEJEAN

L'inactivation somatique de gènes suppresseurs de tumeur est d'importance majeure dans le développement des cancers humains. Dans le but d'identifier des suppresseurs de tumeur potentiellement inactivés au cours du développement du cancer du foie, une cartographie des pertes d'allèles les plus fréquentes (LOH) dans le cancer du foie a été réalisée sur l'ensemble des chromosomes humains. Cet allélotypage nous a permis de mettre en évidence des pertes de matériel génétique fréquentes en 1p, 4q, 6q, 8p, 13q et 16p. Une région de 2cM en 8p23 fait déjà l'objet d'une étude approfondie. Un deuxième allélotypage restreint à l'analyse du chromosome 8 a révélé l'existence de deux autres régions fréquemment délétées en 8p21/23 suggérant la présence de deux nouveaux suppresseurs de tumeur dans ces régions. Parallèlement, nous recherchons des délétions doubles et/ou hétérozygotes dans une centaine de lignées cellulaires tumorales (dont 60 d'origine hépato-biliaire). Des gènes candidats seront potentiellement identifiés dans les régions minimales de perte et des mutations ponctuelles somatiques seront recherchées dans ces gènes. Ces recherches, focalisées dans un premier temps sur le chromosome 8, seront par la suite étendues à d'autres régions chromosomiques, notamment la région 4q. Parallèlement à l'étude de délétions alléliques, nous avons recherché par CGH (Comparative Genomic Hybridization) des amplifications géniques dans l'hépatocarcinome dans le but d'identifier des régions susceptibles d'abriter des oncogènes. Dans 65% des tumeurs, nous avons pu observer une amplification en 1q et 8q. Nous allons porter nos efforts sur l'étude de ces deux régions en priorité. La stratégie employée fera appel à la technique nouvellement décrite de CGH array. Une étude de transcriptome sur le cancer du foie a d'autre part été initiée en collaboration avec l'équipe de MA Buendia dans le cadre du projet national CIT2 de la Ligue Contre le Cancer.

 

Compartimentalistion fontionnelle du noyau et leucémie aiguë promyélocytaire

Responsable : Anne DEJEAN

Parallèlement aux travaux portant sur le cancer du foie, notre équipe étudie depuis plusieurs années le rôle des récepteurs aux rétinoïdes dans l'oncogénèse chez l'homme. Nous avons pu montrer que la translocation t(15,17) associée aux leucémies aiguës promyélocytaires (LAP) génère une protéine hybride entre la protéine PML et le récepteur a de l'acide rétinoïque (PML-RARa ). La protéine PML est localisée au niveau de structures subnucléaires appelées corps nucléaires qui sont désorganisées de manière réversible par l'acide rétinoïque dans les cellules LAP. Cette observation, qui permet d'impliquer une structure nucléaire dans une pathologie humaine, corrèle de façon frappante avec l'effet thérapeutique des rétinoïdes dans ce type d'hémopathie. Nous avons montré récemment que les protéines PML et SP100, les deux composants majeurs des corps nucléaires, sont modifiées de façon covalente par une petite protéine apparentée à l'ubiquitine appelée SUMO-1. Cette modification, contrairement à l'ubiquitination, n'est pas associée à une dégradation protéique mais semble jouer un rôle majeur dans la compartimentalisation subcellulaire des protéines. Ainsi la ‘sumoylation' de PML est-elle déterminante pour son adressage vers les corps nucléaires ainsi que pour le maintien de l'intégrité structurale de ces ‘organelles'. Compte-tenu du lien étroit existant entre la sumoylation et la dynamique des corps nucléaires, nous consacrerons un effort important à l'étude de cette nouvelle voie de modification post-traductionnelle afin de clarifier son rôle dans l'organisation générale du noyau de la cellule normale et de la cellule leucémique. Parallèlement, nous tenterons d'élucider la fonction des structures nucléaires PML et notamment leurs relations avec le compartiment chromatinien.

Les Corps Nucléaires PML

 

Prévention et traitement des infections virales chroniques par vaccination spécifique

Responsable : Marie-Louise Michel

Notre recherche est orientée vers l'immunothérapie des infections chroniques dues au virus de l'hépatite B (HBV) et au virus de l'immunodéficience humaine (HIV). Les approches basées sur ces virus pourraient avoir un intérêt général en médecine humaine et vétérinaire et en immunothérapie anti-cancer.

Les infections par le virus de l'hépatite B conduisent à un portage chronique du virus dans 5 à 10 % des cas après infection à l'âge adulte et dans plus de 90 % des cas lors de l'infection périnatale. Ces infections chroniques exposent les patients à un risque d'hépatopathie chronique et au carcinome hépatocellulaire. On compte à l'heure actuelle plus de 350 millions de porteurs chroniques de ce virus qui représentent, par ailleurs, un réservoir important pour la dissémination du virus. Les approches thérapeutiques actuelles comme l'interféron-alpha et la lamivudine sont peu efficaces à long terme et le développement de traitements par immunothérapie spécifique pourrait être d'un grand intérêt pour ces patients.

Nous étudions l'immunogénicité de différentes préparations vaccinales combinées ou non à des adjuvants pour l'induction ou l'activation de réponses immunitaires T et B qui sont déficientes chez les porteurs chroniques du virus. En utilisant, comme modèle animal des souris transgéniques pour l'antigène de surface du virus (AgHBs), différentes approches ont été étudiées pour rompre la tolérance à cet antigène. Ces travaux ont conduit à une étude pilote puis à une étude clinique randomisée de vaccination thérapeutique. Nous avons montré qu'il était possible d'induire par la vaccination, chez ces patients, une réponse immunitaire spécifique de type CD4+ corrélée chez certains d'entre eux à l'élimination du virus. D'autre part, nous travaillons à un nouveau mode d'immunisation basé sur l'injection intramusculaire d'ADN codant pour les protéines d'enveloppe du virus de l'hépatite B. L'immunisation génétique de souris transgéniques pour la molécule HLA-A2 a montré que les épitopes présentés après découpage in vivo étaient très comparables à ceux qui sont reconnus chez l'homme au cours de l'infection naturelle. Dans le modèle des souris transgéniques pour l'AgHBs, l'injection d'AgHBs couplé à des oligonucléotides contenant des motifs CpG stimule des lymphocytes T spécifiques de l'antigène viral, produisant des cytokines de type Th1 mais n'exerçant pas d'activité lytique in vitro ou in vivo. Ces lymphocytes sont capables de réguler l'expression des gènes viraux au niveau du foie des souris transgéniques par un mécanisme n'impliquant pas la lyse des hépatocytes. Pour étudier les mécanismes impliqués dans la tolérance à l'AgHBs nous avons développé une lignée de souris doublement transgénique AgHBs/HLA-A2. Ce modèle d'étude des porteurs chroniques devrait nous permettre d'élaborer de nouvelles stratégies de vaccination destinées à restaurer les fonctions des cellules T tolérisées en périphérie chez les porteurs chroniques infectés à la naissance. L'ensemble de ces travaux nous ont conduit à réaliser, en collaboration avec les cliniciens de l'hôpital Necker (Pr. Bréchot et Pr. Pol, Dr. H. Fontaine), un essai clinique de phase I de " vaccinothérapie spécifique par ADN nu ", dans lequel nous étudions la réponse immunitaire induite.

Enfin, les différents travaux réalisés sur l'AgHBs et sur la modulation de la réponse immune par la vaccination nous ont conduit à proposer cet antigène comme vecteur pour la présentation d'épitopes dérivés d'autres pathogènes et la stimulation spécifique du système immunitaire dans le modèle de l'infection par VIH et SIV. Un essai pilote de vaccination est en cours chez le macaque. L'efficacité et le pouvoir protecteur de vecteurs DNA hybrides codant pour des particules pseudo virales HIV/HBsAg sera testée vis-à-vis d'une épreuve infectieuse avec le virus SHIV (collaboration avec Y. Rivière, IP et R. LeGrand, CEA)

 

Relation entre les virus d'hépatite B (HBV) et C (HCV) et leur hôte.

Responsable : Catherine TRANSY

Les virus d'hépatite B et C sont tous deux la source de problèmes majeurs de santé publique, d'autant plus préoccupants que les traitements anti-viraux actuellement disponibles montrent une efficacité limitée. Dans ce contexte, nos études visent à caractériser les interactions moléculaires mises en jeu par HBV et HCV, au cours de l'infection, dans le but de définir de nouvelles cibles thérapeutiques.

La protéine régulatrice X du virus HBV est indispensable à l'établissement de l'infection bien que son rôle précis n'ait pas été identifié. Nous avons montré que l'interaction productive entre X et la protéine cellulaire UV-DDB ou DDB1 est une étape clef, non seulement pour les activités de la protéine virale mesurables in vitro (transactivation et apoptose), mais aussi pour l'établissement de l'infection virale, in vivo. Nos résultats récents indiquent que DDB1 module la stabilité de X en inhibant sa dégradation rapide par le protéasome et que la surface d'interaction de la protéine X avec DDB1 est très courte (15 acides aminés). L'ensemble de ces observations nous oriente vers la recherche d'antiviraux ciblant l'interaction X-DDB1. Dans cette optique, nous avons établi une lignée cellulaire dans laquelle l'activité de la protéine X est inductible au niveau post-traductionnel. L'induction de cette activité provoque un changement morphologique drastique des cellules, suivi de leur apoptose. Ce système sera exploité pour (1) l'évaluation de candidats anti-viraux dérivés du domaine d'interaction minimal de X avec DDB1 et la mise au point de cribles fonctionnels de substances chimiques sur leur aptitude à sauvegarder la cellule de l'apoptose induite par X et (2) la caractérisation cinétique des événements enclenchés par l'induction de l'activité X.

En raison de l'absence de système cellulaire permettant de propager le virus HCV, on connait mal la nature et la fonction des interactions entre les protéines virales matures, qui dérivent de la protéolyse d'un précurseur unique. Il en est de même pour les interactions entre le protéome viral et celui de l'organisme hôte. Nous avons développé des outils d'expression en cellules humaines d'une collection de domaines aléatoires couvrant toute la polyprotéine virale. Ces outils seront exploités pour compléter l'analyse des interactions entre protéines virales que nous avions préalablement réalisée par la méthode double-hybride, identifier des interactions engagées entre les protéines virales et celles de l'hôte, identifier des épitopes viraux B et T.

Légende:

Hépatocytes humains primaires en contraste de phase et expression de la ß-caténine transduite par un vecteur lentiviral.



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

DA Louise-Marie IP lmda@pasteur.fr

BUENDIA Marie-Annick DR1 CNRS mbuendia@pasteur.fr

DEJEAN Anne DR1 INSERM adejean@pasteur.fr

MICHEL Marie-Louise DR2 INSERM maloum@pasteur.fr

NEUVEUT Christine CR2 INSERM cneuveut@pasteur.fr

PINEAU Pascal CR IP ppineau@pasteur.fr

TRANSY Catherine DR2 INSERM ctransy@pasteur.fr

WEI Yu CR IP ywei@pasteur.fr

BIANCHI Julie Vacataire INSERM

BISCHOF Oliver Post-doc

KIRSH Olivier Thèse

LABALETTE Charlotte DEA

LEVY Laurence Thèse

LOIRAT Delphine Thèse

NACERDDINE Karim Thèse

PUAUX Anne-Laure Thèse

SEELER Jacob Post-doc

WU Yuanfei Thèse

ZHANG Menghua Post-doc

BERGAMETTI Françoise Ingénieur, Paris 7

BOURGINE Maryline Ingénieur, IP

BRES Evelyne Ingénieur, IP

MARCHIO Agnès Ingénieur, IP

RENARD Claire-Angélique Technicienne Supérieure, IP

GEORGES Monique IP

LEGOUT Claudine IP

LEGUEULT Catherine IP

QUEROL Chantal IP


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