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  Rtg


  Responsable : HEARD Jean Michel (: jmheard@pasteur.fr)


  resume

 

Une thématique de l'unité consiste dans le développement de stratégies pour la thérapie génique. Les modèles étudiés concernent le système nerveux et l'érythropoïèse. Ils font appel aux vecteurs dérivés des lentivirus ou des AAV. L'unité s'intéresse également aux interactions entre les rétrovirus et les cellules cibles de l'infection. Les travaux portent sur les étapes très précoces de l'entrée virale, la présentation d'antigène viraux et les rôles de la protéine Nef du VIH-1.



  rapport

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Développement de stratégies pour la thérapie génique.

Thèmes portant sur le système nerveux.

Les maladies de surcharge lysosomale peuvent être corrigées par un apport substitutif de l'enzyme manquante. Pour celles qui affectent le système nerveux central, qui sont les plus fréquentes, cet apport ne peut se concevoir que par la sécrétion de l'enzyme in situ. Celle-ci peut être obtenue par une manœuvre de transfert de gène. L'injection stéréotaxique de vecteurs AAV ou de vecteurs lentiviraux codant pour l'enzyme manquante dans le cerveau transforme un petit nombre de cellules en une source d'enzyme. Celle-ci peut être transportée à distance et corriger les lésions due à la maladie dans l'ensemble du cerveau et du cervelet. Nous avons obtenu ces résultats dans le modèle de la souris MPS VII déficitaire en ß-glucuronidase, puis chez la souris MPSI, déficitaire en a-iduronidase, qui représente un modèle de la maladie de Hurler, relativement fréquente chez l'enfant (N. Desmaris). Nous avons, avec l'aide de l'AFM, installé en France une colonie de chiens atteints de la maladie de Hurler et commençons à étudier l'efficacité du transfert de gène dans le cerveau des chiots malades. L'objectif immédiat est de juger de la faisabilité de cette méthode pour le traitement des enfants atteints et de décider de l'opportunité d'un essai thérapeutique (collaboration avec M. Tadié, laboratoire de Neurochirurgie du CHU Bicêtre et avec P. Moullier, CHU de Nantes).

Les traumatismes de la moelle épinière sont fréquents et souvent responsables d'un handicap sévère chez des sujets jeunes. Nous avons initié cette année un projet de recherche destiné à explorer une méthode de reconstruction après section de la moelle lombaire chez le rat, faisant appel à la microchirurgie et à la thérapie génique. La chirurgie permet de connecter les motoneurones situés au-dessus de la lésion avec les muscles des pattes postérieures, et supprime toutes connections avec la moelle sous-lésionnelle. Un retour de la motricité est observé, mais celle-ci n'est pas adaptée à la locomotion. Ce modèle est utilisé pour évaluer l'efficacité du transfert de gènes codant pour des facteurs favorisant la survie neuronale, la plasticité médullaire et la repousse axonale (S. Liu, D. Bohl).

Thème portant sur l'érythropoièse.

L'objectif de ce projet est de stimuler une érythropoièse de type fœtal, où l'hémoglobine est de forme a 2/g 2, chez des sujets ß-thalassémiques déficitaires pour la synthèse de la chaîne ß. La stratégie repose sur l'induction prolongée d'une érythropoièse de stress, majoritairement de type fœtal, par l'apport de quantités importantes d'érythropoiétine (Epo). La stimulation intense accélère la différenciation des progéniteurs érythroïdes très précoces et évite l'extinction du gène g -globin. Nous avons décrit ce mécanisme et validé cette stratégie chez la souris ß-thalassémique en utilisant le transfert de vecteurs codant pour l'Epo de souris dans le muscle. Une correction de la maladie a été obtenue par l'electrotransfert d'ADN nu ainsi qu'avec des vecteurs AAV dans lesquels le niveau d'expression de l'Epo est contrôlée par la tétracycline. Cette méthode peu onéreuse, relativement sure en ce qui concerne l'utilisation d'ADN nu, et facile à mettre en œuvre pourrait s'avérer appropriée pour le traitement des millions de patients ß-thalassémiques vivant dans des pays en développement, en particulier en Asie du sud-est (S. Samakoglu, D. Bohl).

 

Etude des phases précoces de l'infection rétrovirale.

Topologie et oligomérisation de PiT-2, récepteur rétroviral et transporteur de phosphate inorganique.

PiT-2 sert à l'ancrage des particules rétrovirales portant une enveloppe amphotrope et induit la fusion au décours d'un processus de réorganisation du complexe enveloppe-récepteur. PiT-2 transporte également du phosphate inorganique et du sodium. Les deux activités varient en fonction inverse de la concentration de phosphate dans le milieu extracellulaire. Les variations sont rapides, sans synthèse protéique. PiT-2 est une molécule multi-transmembranaire et fortement hydrophobe. Nous avons montré que PiT-2 appartient à une large famille représentée dans tous les règnes. Tous les représentants possèdent une duplication du domaine conservé. Nous avons défini la topologie de PiT-2 et montré que les domaines dupliqués sont orientés symétriquement par rapport à la membrane plasmique. A l'aide d'agents pontants, nous avons montré que PiT-2 forme des assemblées à la surface cellulaire, et que ces assemblées subissent des changements conformationnels en réponse aux variations de la concentration extracellulaire en phosphate. La forme compactée est associée à une forte activité biologique, alors que la forme relaxée est peu ou pas active (C. Salaün, P. Rodrigues).

 

Travaux de l'équipe d'Olivier Schwartz.

Le VIH infecte principalement les lymphocytes T et les cellules présentatrices d'antigène, macrophages et cellules dendritiques. L'infection nécessite la fusion des membranes virale et plasmique afin de libérer la capside dans le cytosol, où se déroulent les phases suivantes du cycle infectieux. La fusion requiert des interactions spécifiques entre glycoprotéine d'enveloppe et récepteurs cellulaires. Les macrophages, et d'une manière distincte les cellules dendritiques, sont capables d'effectuer une capture des particules virales dans des vésicules intracellulaires de manière aspécifique. Nous avons montré que ces vésicules s'apparentent à des vésicules de macropinocytose dans le cas des macrophages, et suggéré que des événements de fusion se déroulent au sein de ces vésicules (V. Maréchal).

Dans le cas des cellules dendritiques, le captage des particules virales est favorisé par une lectine de surface appelée DC-SIGN. Les particules intra-vésiculaires restent infectieuses et peuvent être transmises aux lymphocytes CD4 lors de la présentation d'antigènes. Nous avons mis en évidence que l'expression de DC-SIGN à la surface est augmentée lorsque la cellule est infectée par le VIH-1. Cette augmentation est induite par la protéine virale Nef et conduit à une transmission plus efficace de l'infection virale aux cellules cibles. Les mécanismes de l'action de Nef sur DC-SIGN ont été élucidés. Ils reposent sur une perturbation du trafic intracellulaire de DC-SIGN et font intervenir un motif d'endocytose semblable à celui préalablement reconnu comme une cible de l'effet de Nef sur la molécule CD4 (N. Sol-Foulon, C. Nobile).

La libération des particules virales dans le cytosol après fusion est suivie d'un processus de dé-assemblage et d'une dégradation des capsides. Nous avons mis en évidence que les peptides générés par cette dégradation peuvent rejoindre les molécules de classe I en cours de synthèse et être présentés à des CTL spécifiques. Cette présentation antigénique par la voie exogène, en l'absence de néo-synthèse des protéines virales, joue potentiellement un rôle important dans la réponse immunitaire antivirale (O. Schwartz, collaboration avec F. Buseyne ). Nous étudions actuellement les mécanismes biologiques et cellulaires qui sous-tendent ce phénomène de présentation exogène : Nous examinons particulièrement l'influence de la voie d'entrée du virus dans la cellule, ainsi que le rôle du protéasome. Nous souhaitons également comparer les répertoires d'épitopes viraux présentés de façon exogène ou lors de la néo-synthèse de protéines virales. (A. Moris)



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

Renée Communal, communal@pasteur.fr

Olivier Schwartz, CR Institut Pasteur, schwartz@pasteur.fr

Delphine Bohl, CR2 INSERM, dbohl@pasteur.frs

Nathalie Sol-Foulon, CR2 CNRS, natsol@pasteur.fr

Arnaud Moris, Stage post-doctoral, moris@paseur.fr

Song Liu, Stage post-doctoral, songliu@pasteur.fr

Christine Salaün, Thèse Ecole Doctorale B2M, csalaun@pasteur.fr

Emmanuel Gyan, Etudiant DEA, egyan@pasteur.fr

Cinzia Nobile, Etudiante étrangère, nobileci@pasteur.fr

Valérie Maréchal, Technicienne Supérieure 2D, marechal@pasteur.fr

Nathalie Desmaris, Technicienne Supérieure 1D, nchodan@pasteur.fr


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