Portail IP bandeau_genéral
  Regvir


  Responsable : KEAN, Katherine M. (kathiemb@pasteur.fr)


  resume

 

Les intérêts de cette nouvelle unité de recherche portent sur l'étude des mécanismes moléculaires de la synthèse protéique eucaryote, et la régulation de la traduction qui peut avoir lieu par exemple lors de l'infection par des pathogènes (tels des virus à ARN). Les recherches actuelles sont orientées vers l'étape d'initiation de la traduction, avec une attention particulière pour le recrutement de la sous-unité 40S ribosomique et le rôle des séquences 5'-noncodantes et 3'-terminales des ARNm dans ce processus.



  rapport

cale

Coopération entre la coiffe et la queue poly(A) des ARNm cellulaires

Nous avons précédemment démontré que la l'initiation efficace de la traduction des ARNm cellulaires nécessite une interaction fonctionnelle entre la coiffe en 5' et la queue poly(A) en 3', par le biais d'interactions entre des protéines qui fixent ces extrémités de l'ARN (eIF4E et PABP respectivement, liés tout les deux à l'eIF4G) qui permettent de circulariser physiquement les ARNm cellulaires. Une hypothèse avancée est que la circularisation physique d'un ARNm faciliterait le recyclage des ribosomes qui viennent de terminer un cycle de traduction. Or, nous avons pu cette année réfuter cette hypothèse et même le rôle de la circularisation per se des ARNm pour leur traduction efficace. En effet, nous avons démontré qu'il est tout à fait possible de stimuler la traduction d'un ARN coiffé mais non-polyadenylé en lui fournissant une chaîne poly(A) en trans. Cette stimulation est aussi efficace que l'apport d'une queue poly(A) sur l'ARNm, dépend de la longueur du poly(A) fourni (seules les chaînes de la longueur d'une queue poly(A) physiologique sont capables de stimuler la traduction), et ressemble à l'effet d'une queue poly(A) par tout critère biochimique examiné (Borman et al., soumis à EMBO J).

Mécanisme de traduction des ARNm non-coiffés

Nous avons également étudié le mécanisme d'initiation de la traduction des ARNm dépourvus de coiffe ou de queue poly(A). Nos résultats les plus récents montrent qu'à l'inverse de l'efficacité de traduction d'un ARNm coiffée et polyadenylé qui diminue avec l'augmentation de la longueur de sa région 5'-noncodante, la traduction d'un ARNm non-coiffé mais polyadenylé est significativement plus efficace lors qu'on augmente la longueur de la région 5'-noncodante. Cependant, l'initiation de la traduction sur un tel ARNm reste toujours 5'-dependante. Nous avons pu démontrer clairement que c'est la queue poly(A) en 3' d'un ARNm qui rende l'initiation de la traduction 5'-dependante (Paulous et al., en préparation pour Mol.Cell.Biol.).

Clivage du complexe eIF4F par des protéases des picornavirus

Il est connu depuis longtemps que l'un des composants du complexe d'initiation de la traduction eucaryote eIF4F, eIF4G, est clivé par différentes protéases des picornavirus. Cependant, la conséquence physiologique de ce clivage sur la traduction cellulaire est encore discutée. En effet, de nombreux auteurs ont rapporté que le clivage de l'eIF4G ne peut pas expliquer totalement l'inhibition sélective de la traduction de la cellule hôte constatée lors de l'infection par un picornavirus. Il a été montré tout récemment que la PABP, qui s'associe au complexe eIF4F, est clivée par les protéases 2A et 3C des entérovirus et il a été proposé que ce clivage pourrait contribuer à l'inhibition de la traduction cellulaire. Nous avons déterminé cette année que la PABP peut également être clivé par la protéase 2A du rhinovirus humain, mais pas par une autre protéase capable de cliver l'eIF4G, la protéase Lb du virus de la fièvre aphteuse (Borman et al., 2001, J.Virol. 75, 7864-7871).

Initiation de la traduction chez le virus de l'hépatite A (HAV), un picornavirus à part

Les ARNm des picornavirus font partie de ceux qui sont traduits par un mécanisme alternatif, par initiation à partir d'un IRES (pour Internal Ribosome Entry Segment). Nous avons montré précédemment que l'IRES du HAV ne fonctionne pas lorsque l'eIF4G est clivé, alors que tous les autres IRES des picornavirus sont actifs avec le produit C-terminal de clivage de cette protéine. Maintenant nous avons démontré que l'IRES du HAV fixe la protéine eIF4G, et ceci aussi efficacement qu'elle soit clivée ou intacte, suggérant que ce n'est pas un problème de reconnaissance de la protéine selon sa forme. Cependant, nous avons trouvé que le déplacement d'eIF4E ou de la PABP d'eIF4G inhibe spécifiquement l'activité de l'IRES du HAV. Sachant que l'interaction de PABP ou eIF4E avec l'eIF4G induit des changements majeurs dans la conformation de cette dernière, nous proposons que l'IRES du HAV, à l'instar des IRES des autres picornavirus, est extrêmement sensible à la conformation d'eIF4G, et la nécessite dans exactement la même conformation que fassent les ARNm cellulaires classiques. Cela, couplé au fait que le HAV n'induit aucune inhibition de la synthèse protéique cellulaire lors de l'infection, pourrait expliquer le cycle infectieux extrêmement lent et peu efficace de ce virus (Borman et al., 2001, J.Virol. 75, 7864-7871).

Analyse structure-fonction de l'IRES du poliovirus (PV)

Les IRES des picornavirus sont longues d'environ 450 nt, structurés en différents domaines. Le domaine E est d'une grande importance pour la neurovirulence du PV, contenant des résidus qui sont mutés dans les trois souches vaccinales développées par Albert Sabin. Il présente également une grande boucle latérale, située non loin de ces nucléotides, dont la structure secondaire n'est pas clairement définie. En effet, la conservation de séquence chez les entéro- et rhinovirus serait compatible avec la présentation d'un tetraboucle GNRA et/ou des appariements intra-boucle. Nous avons mené un programme de mutagenèse dirigée ciblée, couplé à des analyses biochimiques et virologiques, destiné à mieux comprendre la structure de l'ARN du domaine E de l'IRES du PV et le rôle de ce domaine dans la fonction de l'IRES. L'étude de mutants de la grande boucle latérale témoigne clairement d'interactions tertiaires intra-domaine, et souligne que toute cette région joue un rôle dans la neurovirulence du PV (Malnou et al., en préparation pour J.Virol.). Lorsque nous avons reproduit les déterminants potentiels d'atténuation des différentes souches vaccinales dans un même contexte génomique, celui du PV de type 1 sauvage, il s'est avéré qu'un seul d'entre eux résulte en un IRES fortement défectueux. Nos derniers résultats concernant ce mutant permettent une nouvelle vision du mécanisme de clivage de l'eIF4G lors de l'infection virale (Malnou et al., en préparation pour J.Biol.Chem.).

Régulation de la capacité traductionnelle du virus de l'hépatite C (HCV)

La traduction du HCV dépend également d'un IRES, mais celui-ci est fort différent des IRES des picornavirus. De plus, l'ARN du HCV porte à son extrémité 3' une séquence hautement structurée d'environ 100 nt (la région X) plutôt qu'une queue poly(A). Nous avons montré l'année dernière que la traduction à partir de l'IRES du HCV est stimulée par la présence de la région X en 3' de l'ARN et nous avons émis l'hypothèse que l'ARN du HCV serait circularisé par l'intermédiaire d'un complexe protéique différent des ARNm cellulaires classiques (Michel et al., 2001, Mol.Cell.Biol. 21, 4097-4109). Maintenant nous avons abordé la question de la variabilité de séquence qui peut exister au niveau de l'IRES du HCV, et les conséquences fonctionnelles de l'évolution de sa séquence au cours de l'infection chez l'homme, par la caractérisation des variants composant les quasi espèces du HCV d'un même individu au niveau de l'IRES (en collaboration avec JM Pawlotsky et M Soler, hôpital Henri Mondor, Créteil). L'analyse phylogénétique des séquences de 6 patients avant et après traitement avec l'interféron alpha, et la détermination des structures secondaires prédites de l'ARN, nous a permis de constater que les quasi espèces de la région 5'-noncodante sont caractérisées par une forte complexité génétique, similaire à celui observé dans d'autres régions du génome. En revanche, la diversité génétique est faible, proche de celle observée dans des régions soumises à de fortes contraintes conservatoires, et la plupart des changements de séquence n'affectent pas la structure prédite de l'IRES (Soler et al., soumis à J.Virol.). Une étude fonctionnelle porte sur des patients infectés avec un HCV du génotype 1b, dont une majorité abrite certains variants qui auraient des IRES avec une même modification importante dans leur structure secondaire prédite, la transformation de la feuille de trèfle JIIIabc en tige boucle simple. Ceci est corrélé avec une efficacité de traduction négligeable. Par ailleurs, un changement précis dans le site de fixation du complexe eIF3 résulte en une hyper stimulation de l'activité de l'IRES par la région X. En revanche, d'autres changements de séquence qui corrèlent avec une déstabilisation de la structure secondaire de l'IRES auraient pour conséquence une perte de la stimulation de son activité par la région X.



  publications

puce Toutes les publications sur notre base de données


  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
   

KEAN, Katherine M., CNRS, (DR2, chef d’Unité, kathiemb@pasteur.fr)

BORMAN, Andrew M., IP, (CR)

MICHEL, Yanne M., étudiante en thèse

MALNOU, Cécile E., étudiante en thèse

QUESNOIT, Mélanie, étudiante en Magistère/DEA

BEAULIEUX, Fréderik, thésard visiteur

NORA, Tamara, étudiante en licence

LHUILLIER, Pierre, étudiant en licence

PAULOUS, Sylvie, (technicien IP)

FANZONE, Nathalie, (technicien IP CDD)


filet

Debut de Page recherche Portail Institut Pasteur

En cas de problèmes, de remarques, ou de questions concernant cette page Web écrire à rescom@pasteur.fr.