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  Responsable : Kolb, Annie (akolb@pasteur.fr)


  resume

 

Notre laboratoire s'intéresse aux mécanismes de régulation de la transcription bactérienne avec deux thèmes principaux : la transition de la phase exponentielle à la phase stationnaire et les étapes précoces de l'infection par le bactériophage T4. Dans le premier cas apparaît un nouveau facteur s alors que dans le second cas, un facteur anti-s essentiel et spécifique du s majeur bactérien est synthétisé par le virus.



  rapport

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L'ARN polymérase est responsable de la première étape de l'expression génétique et la cible de nombreuses régulations. L'holenzyme bactérienne est composée de l'enzyme-coeur E constituée de 5 sous-unités a2bb'w et d'un facteur s . La nature du facteur s détermine la spécificité de reconnaissance de l'ARN polymérase vis à vis du promoteur. De nombreux facteurs s sont induits en réponse aux variations de l'environnement et sont très souvent contrôlés par des facteurs anti-s .

ComparAison Entre les ARN POLYMERASES Es 70AND Es S (S. Anne, A. Kolb, A. Lafon)

Escherichia coli synthétise constitutivement s 70 , le facteur s majeur permettant l'expression des gènes de ménage. A l'entrée en phase stationnaire ou lorsque les bactéries sont soumises à des stress variés, apparaît s S, un nouveau facteur s capable de diriger l'ARN polymérase vers d'autres promoteurs contrôlant des gènes impliqués dans la survie bactérienne et la résistance généralisée au stress. s S et s 70 sont très similaires et reconnaissent pourtant des classes distinctes de promoteurs. Cette discrimination est encore mal comprise et nous avons entrepris une comparaison systématique entre les deux facteurs s .

L'enzyme-coeur est limitant dans la bactérie et les deux facteurs s sont en compétition pour s'associer à l'enzyme-coeur. s S a 5 fois moins d'affinité pour l'enzyme-coeur que s 70. Quels sont donc les facteurs qui permettent à s S de rivaliser avec s 70 ?

Les deux ARN polymérases présentent des structures voisines d'après des expériences de clivage au Fe-BABE, réactif chimique couplé à une cystéine de la protéine. Cependant beaucoup de promoteurs dépendants de s S ne possèdent pas de région —35 consensus mais présentent une cytosine en position —13, juste en amont de la boîte —10. Il existe des éléments de discrimination pour la reconnaissance par les deux ARN polymérases au niveau de la séquence du promoteur et du degré de surenroulement de la matrice. De plus les deux holoenzymes qui induisent des courbures différentes de l'ADN, répondent différentiellement à la présence de ces courbures. De nombreux facteurs de transcription modulent le démarrage de la transcription des promoteurs dépendants de s S et peuvent même déterminer le choix du facteur s .

Regulation par le complexE CRP-AMP cyclique (B. Galan, D. Kotlarz, Y-P Wang)

La protéine réceptrice de l'AMP cyclique, appelée aussi protéine CAP, a été découverte pour son rôle activateur des promoteurs sensibles à la répression catabolique. Elle participe aussi à des réseaux de régulation différents ; elle contrôle l'expression de nombreux promoteurs dépendants de s S. Au promoteur du gène mcc, codant pour la synthèse et le transport de la microcine C7, un petit peptide antibiotique exprimé uniquement en phase stationnaire, le complexe CRP-AMP cyclique est requis pour la transcription du promoteur. In vitro il active efficacement la transcription de mcc par les deux formes d'ARN polymérases Es 70 et Es S. Mais in vivo, seul Es S est capable de lever la répression exercée par H-NS, une petite protéine du nucléoïde d'E. coli qui réprime fortement l'expression génétique (Gonzales-Pastor, San Millan & Moreno, Nature, 1994, 369: 281).

Le complexe CRP-AMP cyclique est aussi requis pour lever la répression par le glucose au promoteur hpaG qui gouverne la synthèse des gènes responsables du catabolisme de l'hydroxyl phényl acétate. Beatriz Galan, une étudiante du laboratoire de José-Luis Garcia (CSIC-Madrid) a montré que même en présence de l'inducteur, c'est seulement en phase stationnaire après avoir complètement épuisé le glucose que l'expression du promoteur est induite sous le double contrôle de CRP et de IHF.

Quand CRP est le seul activateur, il interagit directement par des contacts protéine-protéine avec l'ARN polymérase Es 70 ou Es S à courte distance. En revanche les promoteurs dépendants du facteur s 54 ont un mode de régulation totalement différent. La formation du complexe ouvert nécessite la présence d'un activateur, fixé souvent à longue distance du promoteur, qui hydrolyse un ribonucléoside triphosphate. Le Pr Yiping Wang de l'Université de Pékin a découvert que les promoteurs dépendants du facteur s 54 étaient aussi régulés, mais de manière négative, par le complexe CRP-AMP cyclique au niveau transcriptionnel. Quand le promoteur glnAp2 est activé par NifA, un activateur hétérologue dépourvu de sites de liaison au promoteur, la répression persiste. L'effet inhibiteur peut être éliminé par des mutations dans le gène crp ou par surproduction de l'activateur ou du facteur s 54.

LES INTERACTIONS s / ANTI-s (S. Igonet , G. Orsini)

Les facteurs anti-s sont des protéines régulatrices qui se lient spécifiquement à un facteur s et régulent in vivo la disponibilité et l'activité de ce facteur. Avec AsiA, le facteur anti-s 70 du phage T4, nous nous intéressons au mécanisme d'action de ce facteur ainsi qu'au rôle des contacts amont ARN polymérase-ADN du promoteur dans le fonctionnement de cette protéine de 10 kDa.

En se liant à leur cible, la plupart des facteurs anti-s empêchent l'association du facteur s correspondant avec l'enzyme-coeur. Le mode d'action d'AsiA est différent. En effet, AsiA possède deux fonctions que l'on peut distinguer:

-1. AsiA se lie fortement à la région 4 du facteur s 70 et inhibe la transcription à partir de promoteurs bactériens possédant des motifs consensus " -10-35 " et dépendant de s 70.

-2. La transcription à partir des promoteurs moyens du phage T4 requiert le complexe s 70-AsiA dans l'holoenzyme ainsi que la présence de la protéine MotA du phage, liée au niveau de l'ADN au motif " -30- de ces promoteurs. Au cours du développement du phage, le couple AsiA-MotA permet à l'ARN polymérase de changer de spécificité de reconnaissance et de se réorienter vers d'autres promoteurs .

Nous avons montré que la liaison d'AsiA à la région 4 de s 70 bloque l'interaction fonctionnelle entre s 70 et le motif -35 en amont des promoteurs classiques d'E. coli. Utilisant du glutamate de potassium, nous avons atténué cette inhibition et nous avons pu ainsi analyser en détail le mécanisme par lequel AsiA inhibe la transcription à partir de lacUV5, un promoteur à motif " -10 -35 ". Par cinétique d'empreinte au permanganate, par attaque à la DNaseI et par photo-pontage au laser UV, nous avons montré que l'ARN polymérase contenant AsiA forme lentement un complexe ouvert et actif au promoteur lacUV5. L'effet majeur d'AsiA est ici de ralentir de près de 2 ordres de grandeur l'ouverture de la bulle de transcription. Ce complexe ternaire holoenzyme-AsiA-lacUV5 est activé par la protéine CRP liée à l'AMP cyclique, ce qui indique l'importance des contacts amont ARN polymérase-promoteur pour la formation de ce complexe ternaire. Ainsi, l'ARN polymérase possédant une délétion du domaine C-terminal des sous-unités a est totalement inhibée par AsiA dans les conditions où l'enzyme sans délétion ne l'est pas. Nous étudions à présent les propriétés de l'holoenzyme contenant AsiA vis-à-vis de plusieurs promoteurs précoces et très forts du phage T4. Ces promoteurs possèdent en amont une séquence étendue qui est riche en A/T et le siège d'une courbure. Ici, nous utilisons AsiA comme une sonde spécifique nous permettant de cartographier des interactions situées dans les régions amont du complexe ARN polymérase-promoteur. Les changements de conformation imposés par AsiA à s 70 révèlent de nouveaux contacts qui seront identifiés et analysés.



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

Lavenir, Armelle, (alavenir@pasteur.fr)

Orsini, Gilbert, Paris 7 (maitre de conférences, orsini@pasteur.fr)

Igonet, Sébastien, Paris 7 (Etudiant DEA, sigonet@pasteur.fr)

Lafon, Anne, Paris 6 (Etudiante DEA, alafon@pasteur.fr)

Wang, Yiping, Université de Pékin (Professeur, ypwang@pasteur.fr)

Anne, Sandrine (Technicienne, sanne@pasteur.fr)

Kotlarz, Denise, CNRS (Ingénieur d’études, denisek@pasteur.fr)


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