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  Responsable : Michel VERON (mveron@pasteur.fr)


  resume

 

Les thématiques du laboratoire sont :

  • Etude du rôle de la Nucléoside Diphosphate (NDP) kinase dans la phosphorylation des analogues de nucléotides utilisés dans les thérapies anti-virales.
  • Etude de l'interaction de la NDP kinase humaine de type B avec l'ADN simple brin et de son rôle dans la régulation de la transcription de l'oncogène c-myc.
  • Etude des propriétés biochimiques de la protéine NEMO, élément régulateur essentiel de la voie de transduction NF-kB impliqué dans deux maladies génétiques humaines.
  • Etude de la protéine kinase dépendante de l'AMPc chez Dictyostelium et recherche d'inhibiteurs spécifiques.
  • Etude de la recombinaison chez les rétrovirus in vitro.



  rapport

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Mécanisme catalytique de la NDP kinase

Benoit schneider, sarah gallois-Montbrun et Dominique deville-bonne

La Nucléoside Diphosphate Kinase (NDP kinase) échange un phosphate entre nucléosides triphosphates et diphosphates. La réaction catalytique de type ping-pong implique un intermédiaire enzymatique phosphorylé transitoirement sur une histidine. La fonction 3'-OH du ribose du nucléotide substrat est impliqué dans le mécanisme réactionnel qui est de type " assisté par le substrat " (Fig.1).

Nous étudions le mécanisme catalytique grâce à des enzymes mutées sur des résidus du site actif. Les mutants H122G  et H122A de la NDP kinase de Dictyostelium n'ont plus d'activité NDP kinase mais ils catalysent la synthèse d'imidazole-phosphate à partir d'ATP et d'un nucléophile exogène comme l'imidazole (collaboration D. Herschlag, Standford, USA). Par ailleurs, l'état d'ionisation de deux résidus importants dans le transfert de phosphate (Lys 16 et Tyr 56) a été étudié. Dans l'enzyme sauvage, les deux résidus, protonés dans la forme active de l'enzyme, sont en interaction alors que dans le mutant K16A, la Tyr56 présente un pK anormal. Cependant, le remplacement de ces résidus dits " catalytiques " entraîne une diminution d'activité plus faible que l'absence du 3'OH du nucléotide. Un analogue stable de l'enzyme phosphorylé a pu être synthétisé en modifiant chimiquement le mutant inactif H122C. Cette forme pseudophosphorylée présente une plus grande affinité pour les NDP que pour les NTP. la NDP kinase de Dictyostelium est plus réactive que les formes humaines majeures A et B. La comparaison des sites actifs montre que le résidu His qui interagit avec un oxygène du phosphate alpha dans l'enzyme de Dictyostelium (His59 in Fig. 1) est remplacé par une leucine dans les enzymes humaines. Nous avons donc produit la protéine mutante L55H de la NDPK-A qui présente effectivement une activité améliorée.

Phoshorylation in vitro des analogues de nucléotides utilisés dans les thérapies anti-virales par la NDP kinase

Benoit schneider, Sarah GALLOIS-MONTBRUN, Céline BOULARD et Dominique deville-bonne

Malgré la découverte de nouveaux inhibiteurs de la croissance virale, les analogues de nucléotides substitués sur la position 3' du ribose comme l'AZT restent indispensables dans tous les protocoles thérapeutiques contre le SIDA. Ils sont toujours donnés aux malades sous forme de nucléosides, molécule non chargée qui peut traverser la membrane plasmique. Les analogues sont phosphorylés en dérivés triphosphates par plusieurs kinases cellulaires pour pouvoir agir comme terminateurs de chaines au niveau de la transcriptase inverse. La NDP kinase est considérée comme responsable de la dernière étape de cette voie d'activation.

Nous étudions la réactivité de la NDP kinase humaine recombinante avec plusieurs analogues actuellement utilisés en thérapie anti-VIH (ddI, ddC, AZT, d4T) au niveau biochimique et structural (collaboration J. Janin, LEBS à Gif-sur-Yvette). Par des études à l'état préstationnaire, nous avons montré que la phosphorylation des dérivés diphosphate des analogues est beaucoup moins efficace que pour les nucléotides naturels, ce qui fait de la réaction catalysée par la NDP kinase une étape limitante dans leur activation. Nous avons déterminé les constantes cinétiques et les constantes de fixation de ces différents analogues. La combinaison des études biochimiques et des structures des complexes a permis de proposer un modèle mécanistique précis de la phosphorylation de ces agents thérapeutiques par la NDP kinase.

Le 3TC est un dérivé de configuration -L de la thiacytidine utilisé depuis récemment en thérapie contre le SIDA et l'hépatite B et des beta-L-désoxynucléosides (beta-L-thymidine et la beta-L-2'-désoxycytidine) ont été reconnus récemment comme des agents potentiels anti-hépatite B. La réactivité des nucléotides et désoxynucléotides de configuration -L avec la NDP kinase humaine est très réduite, en particulier pour le 3TC (collaboration A. Faraj et J.P. Sommadossi (Laboratoire Novirio-CNRS et Université Montpellier II). Ces résultats suggèrent que d'autres kinases, actuellement inconnues, assurent la formation des L-dXTP au sein de la cellule.

La ribavirine, analogue de guanosine, est le seul analogue de nucléoside utilisé contre les virus à ARN et elle pourrait constituer un médicament contre le virus de la dengue, responsable de fièvres hémorragiques. Elle est active au niveau cellulaire sous forme triphosphate. Nous avons évalué l'efficacité d'une série de dérivés de la ribavirine modifiés sur la base afin de rechercher un analogue qui soit actif à faible dose et qui génère moins de cytotoxicité. Cependant, aucun de ces dérivés ne présente des propriétés de phosphorylation accrue comparées à la ribavirine, ce qui est probablement dû à l'absence d'un groupe 3'OH libre sur le sucre (collaboration L. Mulard, Unité de Chimie Organique, Institut Pasteur et B. Canard, ESIL,CNRS, Marseille).

Mise au point de nouveaux analogues de nucléosides et de variants de la NDP kinase à capacité de phosphorylation accrue

Benoit schneider, Sarah GALLOIS-MONTBRUN, Véronique Giaccomoni-fernandes, Céline boulard et Dominique deville-bonne

Nous avons conçu de nouveaux inhibiteurs de la transcriptase inverse par introduction d'un groupe borano (BH3) sur l'a-phosphate du nucléoside (collaboration L. Mulard, Unité de Chimie Organique, Institut Pasteur). Les propriétés biochimiques des dérivés boronates de l'AZT et du d4T ont été caractérisées in vitro sur la NDP kinase et la transcriptase inverse. La structure cristallographique du complexe NDP kinase/analogue permet de comprendre la meilleure réactivité des dérivés avec les deux protéines. L'efficacité au niveau cellulaire de ces composés, est cependant limitée par le fait qu'ils pénètrent difficilement dans la cellule à cause de la charge électrique portée par le monophosphate (collaboration P. Clayette, CEA et C. Périgaud, CNRS-Montpellier). Des procédés de " vectorisation " qui permettraient la pénétration de prodrogue dans les cellules infectées sont actuellement en cours d'étude.

Dans une approche d'ingénierie des protéines, nous cherchons à modifier la NDP kinase humaine au niveau de son site actif pour qu'elle devienne un meilleur agent de conversion des pro-drogues nucléosidiques en nucléotides au sein des cellules infectées. Plusieurs protéines mutantes ont été obtenues qui phosphorylent le d4T et l'AZT avec des constantes cinétiques fortement augmentées en comparaison des protéines de type sauvage. L'effet le plus marqué est obtenu en combinant deux mutations correspondant à deux résidus du site actif. L'enzyme mutant purifié montre un changement de spécificité de plus de 300 fois. Les travaux en cours ont pour but de déterminer si la présence de cette protéine mutante dans des cellules altère leur capacité de phosphoryler les analogues de nucléotides et leur sensibilité à ces drogues dans la perspective d'applications, notamment dans le cadre des techniques de thérapie cellulaire.

Interaction de la NDP kinase humaine de type B avec l'ADN simple brin

Sharona Raveh, Fei YE, Véronique Giaccomoni-fernandez et Fabrice Agou

L'une des isoformes de la NDP kinase humaine, la NDPK-B, participe à la régulation de l'expression de l'oncogène c-myc. En utilisant la protéine recombinante et des oligonucléotides synthétiques, nous avons montré que la NDPK-B se fixe sur l'ADN simple brin. En utilisant une technique de pontage par laser UV couplée à l'analyse de peptides par spectrométrie de masse MALDI-TOF, nous avons identifié les déterminants structuraux impliqués dans les contacts protéine/ADN, ce qui a permis d'élaborer un modèle structural du complexe NDPK-B/oligonucléotide (collaboration J. Rossier, Ecole de Physique et Chimie de Paris). Ce modèle propose que le site actif participe à la fixation de l'oligonucléotide, ce qui a pu être démontré par mutagénèse dirigée de la NDPK-B sur son résidu C-terminal et par des expériences de cinétique effectuées à l'état stationnaire (Fig. 2).

Par pontage in vivo avec un réactif bifonctionnel réagissant avec les résidus cystéine, nous avons montré que la forme oligomérique de la NDPK-B qui se fixe à l'ADN dans le noyau des cellules est l'hexamère. Par des expériences de fluorescence nous avons montré que la NDPK-B favorise la dissociation de l'ADN double brin en simple brin. Ces études indiquent que la NDPK-B est un facteur de transcription " architectural " interagissant avec des séquences d'ADN simple-brin formées dans des régions de l'ADN formant des triplex ou des quadruplex. Par ailleurs, la NDPK-A, une seconde isoforme de NDP kinase humaine, n'a aucune aptitude à se lier à l'ADN in vitro, bien qu'elle soit identique à 88% avec la NDPK-B. Nous avons montré que la NDPK-A, surproduite dans des cellules embryonnaires de souris (MEF), joue un rôle " dominant négatif " sur la transcription de c-myc. Par des pontages chimiques in vivo sur des cellules en culture, nous avons pu mettre en évidence que l'effet dominant négatif résulte d'une augmentation in vivo d'hétéro-hexamères composés de sous-unités de type A et B

Propriétés biochimiques de la protéine NEMO, élément régulateur essentiel de la voie de transduction NF-kB

Fabrice Agou et Stephane Goffinont

La voie de signalisation NF-kB joue un rôle crucial dans la réponse à toute une série de signaux parmi lesquels on peut citer la réponse inflammatoire et la réponse au stress, qui déclenchent la transcription d'une série de gènes spécifiques via l'activation de facteurs de transcription NF-kB. NEMO (NF-kB Essential MOdulator) est une protéine récemment découverte dans l'Unité de Biologie Moléculaire de l'Expression Génique (Institut Pasteur), qui joue un rôle crucial dans l'activation des kinases spécifiques de la cascade NF-kB, en formant un complexe multiprotéique avec elles. Des travaux récents ont établi que deux maladies humaines, Incontinentia pigmenti et dysplasies ectodermiques sont dues à des mutations dans la séquence codante pour la protéine NEMO.

L'étude de NEMO s'effectue en collaboration étroite avec G. Courtois et A. Israël (Unité de Biologie Moléculaire de l'Expression Génique, Institut Pasteur) qui ont les premiers identifié cette protéine. Nous avons réussi à obtenir la protéine NEMO recombinante purifiée en présence de détergents non-ioniques et nous avons étudié sa structure quaternaire. Le clonage et la purification d'un fragment correspondant à une partie du domaine C-terminal a permis d'établir que l'association de la protéine en dimères et trimères est due à une séquence formant des structures en faisceaux torsadés d'hélices " coiled-coil ". L'association de la protéine recombinante avec la protéine chaperon de E. coli DnaK (Hsp 70) suggère un rôle pour ce type de protéine dans l'association de NEMO en oligomères in vivo. L'existence de formes dimériques et trimériques a également été démontrée in vivo par des expériences de pontages avec un réactif bivalent effectuées sur des cellules en culture. Les expériences en cours ont pour but d'établir un lien entre les mutations identifiées dans le gène de NEMO chez des patients et l'altération des propriétés biochimiques de NEMO examinée in vitro.

La protéine kinase dépendante de l'AMPc chez Dictyostelium et chez Plasmodium falciparum

François TraincarD

Les amibes de Dictyostelium discoideum s'engagent dans un cycle de différenciation quand elles sont privées d'apport nutritif. Après quelques heures, elles migrent en réponse à des signaux d'AMPc pour former un "agrégat" multicellulaire. A ce stade les cellules se différencient et s'organisent en une forme fructifère formée d'une tige supportant une masse de spores.

Par le passé, nous avons étudié le rôle de la protéine kinase dépendante de l'AMPc (PKA) dans le développement de Dictyostelium et nous avons étudié les propriétés biochimiques des sous-unités R (régulatrice) et C (catalytique). Nous avons montré que les derniers acides aminés de l'extrémité C-terminale de la sous-unité C sont indispensables à l'activité enzymatique et nous avons récemment mis en évidence un nouveau site inhibiteur des protéines kinases de la famille AGC (PKA, PKG, PKC). Ce site pourrait être présent plus généralement chez d'autres protéines kinases.

Chez certains pathogènes comme Plasmodium falciparum, la PKA est une cible thérapeutique potentielle. Nous avons en effet mis en évidence une activité PKA indispensable à la maturation des parasites dans des globules rouges infectés par Plasmodium (collaboration G. Langsley, Unité de Signalisation Immunoparasitaire, Institut Pasteur).

Nous avons commencé à utiliser Dictyostelium comme support de travaux pratiques de biologie pour des étudiants de classes primaires, de collèges et de lycées. La communication cellulaire, la différenciation et le développement, la relation avec le milieu trouvent, entre autres, matière à illustration dans l'utilisation de l'amibe comme outil pédagogique.

Etude de la recombinaison in vitro chez les rétrovirus

Abdeladim Moumen, Lucette POLOMACK et Matteo NegronI

La recombinaison constitue une des sources principales de variabilité génétique chez les rétrovirus. Son importance dans la dynamique de l'infection par les rétrovirus a été illustrée par l'expansion de la pandémie du SIDA où au moins 10 % des souches infectieuses ont pour origine une recombinaison entre des sous-types viraux. Chez les rétrovirus, la plupart des recombinaisons sont générées par l'échange de matrice, pendant la transcription inverse, entre les deux copies d'ARN génomique présentes dans la particule virale. Ce processus est appelé " échange de brin " ou " choix de copie ".

Nous étudions le mécanisme de choix de copie in vitro dans un système reconstitué en utilisant des éléments (protéines et acides nucléiques) purifiés. Nous nous intéressons en particulier au rôle des structures secondaires des ARNs génomiques. Nous avons récemment montré que ce sont les structures de ces ARN qui jouent le rôle prédominant dans le mécanisme de recombinaison et non, comme généralement admis, la propension de la transcriptase inverse à faire des pauses lors de la copie du génome viral. Une partie de notre travail a été dirigée à la compréhension du rôle de la protéine virale nucléocapside (NC) dans le processus de recombinaison (Fig. 3). Cette protéine qui constitue un élément important du complexe de transcription inverse, est connue pour augmenter la fréquence de recombinaison in vitro. Nos résultats suggèrent que cet effet est dû à l'activité de chaperon d'ARN de la NC. Les expériences en cours visent à une meilleure compréhension du mécanisme moléculaire du processus in vitro, et au développement d'un système pour l'étude de la recombinaison retrovirale en culture de cellules (collaboration P. Charneau, Unité de Virologie Moléculaire et Vectorologie, Institut Pasteur).

 

Figure 1 : Le siteactif de la NDP kinase

La figure montre une molécule de dTDP fixée dans le site actif de la NDP kinase de Dictyostelium . On reconnaît l'histidine catalytique (H122) et plusieurs résidus contribuant à la fixation du nucléotide substrat. La liaison hydrogène cruciale entre le 3'OH du ribose et l'O7 du a-phosphate est indiquée.

 

Figure 2 : Modèle du complexe NDPK-B/Oligonucleotide

Un oligonucléotide est fixé à la NDPK-B.

 

Figure 3 : Modèle de la recombinanison par la reverse transcriptase du VIH

Un possible intermédiaire de recombinaison. Vue d'en haut de la sous-unité catalytique de la transcriptase inverse du VIH-1. Puisque l'enzyme ressemble à une main droite, ses différents sous domaines ont été appelés doigts, paume, et pouce. Le domaine RNase H, qui dégrade l'ARN matriciel une fois recopié au site de polymérisation, est montré en rouge. Le schéma montre l'enzyme en train de polymériser sur un ARN donneur. L'ARN accepteur est dessiné en orange, hybridé à l'ADN naissant derrière le site RNase H. Le repliement de l'ARN accepteur est dessiné de façon arbitraire et il se lève du plan du dessin vers le lecteur. Selon notre hypothèse de travail, le repliement de l'ARN accepteur est crucial pour déplacer l'ARN donneur du site catalytique de l'enzyme. Nous essayons de disséquer le mécanisme responsable de ce remplacement.



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POLOMACK Lucette (Technicienne supérieure, IP) – polomack@pasteur.fr

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