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  Responsable : Namane Abdelkader (anamane@pasteur.fr)


  resume

 

L'objectif principal du Plateau technique de Protéomique est de mettre en place une technologie performante associant l'électrophorèse bidimensionnelle et la spectrométrie de masse nécessaire à l'identification et à la caractérisation des protéines. Notre activité scientifique, comprenant de nombreuses collaborations, est associée à une activité de service.



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Le Plateau Technique de Protéomique a été créé en décembre 2000, dans le cadre de la Génopole Institut Pasteur. Son objectif est de mettre à disposition une technologie performante en électrophorèse bidimensionnelle et en spectrométrie de masse pour la réalisation de projets de recherche. A l'heure actuelle, la première est la technique la plus résolutive pour la séparation des protéines. Au sein du Plateau Technique, la procédure Ampholines est standardisée et optimisée pour tous types d'extraits protéiques. De plus, nous débutons la mise en place de la procédure Immobilines afin d'optimiser la séparation des protéines dans les gammes de pH basiques d'une part et dans des gammes très étroites de pH d'autre part. En ce qui concerne la spectrométrie de masse, nous disposons de deux appareils complémentaires, l'un de type maldi-tof (Voyager DE-STR) et l'autre de type électrospray triple quadripôles (API 365 Sciex), nous permettant l'identification des protéines dans les banques de données à partir de leur digestion par la trypsine dans le gel d'électrophorèse et la caractérisation des biomolécules.

Au cours de l'année 2001, en collaboration avec plusieurs unités de recherche, nous avons mis en œuvre deux types d'approches protéomiques pour l'identification des protéines d'intérêt : une approche globale et une approche ciblée.

Pour l'approche globale, en collaboration avec P. Bertin (Génétique des Génomes Bactériens), une étude des effets d'une baisse de pH sur les profils protéiques de la bactérie Vibrio cholerae a été réalisée, et a montré que la majorité des protéines variantes identifiées faisait partie de la classe fonctionnelle regroupant des protéines de l'enveloppe et de processus cellulaires. Cette analyse globale a également permis de réaliser une première ébauche de cartographie 2D du protéome de cette bactérie. Avec cette même équipe, nous avons aussi commencé chez Photorhabdus luminescens, l'étude des mécanismes de contrôle de la synthèse des toxines et des protéines impliquées dans le processus infectieux chez l'insecte hôte.

Nous avons également réalisé ce type d'analyse globale dans le cadre de projets visant à identifier des protéines impliquées dans les processus de virulence chez divers microorganismes pathogènes, tels que Mycobacterium tuberculosis (en collaboration avec J. M. Reyrat, Génétique Mycobactérienne) et Staphylococcus aureus (en collaboration avec B. Fournier, Biochimie Microbienne).

L'approche ciblée dans le cadre de l'analyse protéomique implique l'enrichissement en protéines d'intérêt par diverses méthodologies. Les exemples suivants illustrent cet aspect.

Par l'analyse d'une fraction protéique issue d'un compartiment cellulaire donné, des protéines de faible abondance peuvent être visualisées, et ainsi permettre la réalisation d'un inventaire protéique de ce compartiment. En collaboration avec S. Cole (Génétique Moléculaire Bactérienne), nous avons commencé à identifier les protéines membranaires chez Mycobacterium tuberculosis.

L'analyse fonctionnelle de fractions protéiques  ayant une localisation cellulaire précise est plus sélective. Ainsi avec S. Mecheri (Immuno-allergie) une collaboration est en cours pour identifier les protéines immunostimulantes associées aux exosomes mastocytaires murins. Ces protéines sont produites spécifiquement lors du traitement des cellules par IL3 ou IL4.

Avec cette même approche, et en collaboration avec N. Guillen (Biologie Cellulaire Parasitisme), une analyse des phagosomes d'Entamoeba histolytica, parasite humain, est en cours afin d'identifier des protéines impliquées dans les processus de phagocytose.

Les réseaux complexes d'interactions entre protéines participent probablement à l'origine des processus de régulations biologiques et par conséquent leur mise en évidence est essentielle. En collaboration avec A. Jacquier (Génétique des Interactions Macromoléculaires), par la méthode du TAP (Tandem Affinity Purification) nous étudions et identifions les partenaires constituants des complexes protéiques chez la levure.

Un autre aspect de notre activité concerne la caractérisation structurale des biomolécules. Avec G. Marchal (Laboratoire de Référence des Mycobactéries), dans le cadre du PTR qu'il dirige, nous collaborons à la caractérisation de la protéine Apa exportée par les mycobactéries. Au cours de ce travail, nous avons montré que Apa est une protéine ayant des modifications post-traductionnelles correspondant à la présence d'une série de résidus de mannose. Par digestion de la protéine Apa par la subtilisine, puis analyse de l'hydrolysât par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse, nous avons mis en évidence les sites potentiels de glycosylation.

Parallèlement à ces contributions, le Plateau Technique de Protéomique a également une activité de service.



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
       

Laurent-Winter, Christine, Ingénieur, chwinter@pasteur.fr

Lenormand, Pascal, Technicien Supérieur, plenorma@pasteur.fr

Namane, Abdelkader, Ingénieur, anamane@pasteur.fr

Rousselle, Jean-Claude, Ingénieur, jroussel@pasteur.fr


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